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1 基因打靶技术的发展简史及其应用前景1

1.1 基因打靶技术的概念1

1.2 胚胎干细胞技术的发展2

1.3 同源重组技术的发展3

1.4 基因打靶技术在生物医学研究中的应用前景4

1.4.1 基因打靶技术在基因功能研究中的应用4

1.4.2 应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型5

1.4.3 应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器6

2 基因打靶的策略及载体设计10

2.1 完全基因剔除10

2.1.1 构建载体的一般原则11

2.1.2 置换型载体13

2.1.3 插入型载体16

2.1.4 影响中靶效率的因素18

2.1.5 体细胞打靶21

2.2 基于 Cre-LoxP 重组酶系统的条件基因打靶25

2.2.1 Cre-LoxP 重组酶系统25

2.2.2 构建基因打靶载体要考虑的问题和 LoxP 的合理运用27

2.2.3 条件基因打靶30

2.2.4 表达 Cre 重组酶的转基因小鼠34

2.3.1 “Hit and Run”法44

2.3 用基因打靶技术引入精细突变44

2.3.2 双置换法46

2.3.3 “标记和置换”法47

2.3.4 利用 Cre-LoxP 系统引入点突变48

2.4 大片段染色体的重排和删除50

2.4.1 放射线诱导的缺失突变50

2.4.2 Cre-LoxP 介导的染色体重组51

2.5 随机基因剔除——基因诱捕57

2.5.1 诱捕载体的设计58

2.5.2 基因诱捕载体导入 ES 细胞的方法62

2.5.3 诱捕 ES 细胞的筛选和鉴定63

2.5.4 基因诱捕研究的应用及其前景65

2.6 ENU 诱导点突变与大规模基因突变和功能研究69

2.6.1 ENU 诱变的机制70

2.6.2 ENU 诱导的突变类型和诱变效率71

2.6.3 ENU 剂量对不同小鼠品系的影响71

2.6.4 ENU 诱导突变的策略72

2.6.5 ENU 诱导突变表型的筛选77

2.6.6 ENU 诱导点突变的鉴定78

2.6.7 ENU 诱变研究的应用前景79

2.7 利用基因敲入技术制备转基因动物81

2.7.1 利用基因敲入技术制备转基因动物的策略82

2.7.2 基因敲入法制备转基因动物的应用85

2.7.3 结语90

3 中靶胚胎干细胞的筛选94

3.1 胚胎干细胞的分离和培养95

3.1.1 ES 细胞的培养基95

3.1.2 成纤维细胞用作 ES 细胞的饲养层细胞96

3.1.3 小鼠 ES 细胞的分离98

3.1.4 ES 细胞的鉴定101

3.2 打靶载体转染 ES 细胞103

3.2.1 电穿孔法转染 ES 细胞的条件104

3.2.2 选择合适的抗性培养基104

3.3 对发生同源重组的单克隆的筛选105

3.3.1 阳性 ES 克隆的挑取106

3.3.2 阳性 ES 克隆的冻存107

3.3.3 ES 克隆基因组 DNA 的制备107

3.3.4 PCR 法筛选中靶 ES 细胞107

3.3.5 Southern 杂交法筛选中靶 ES 细胞108

3.4 ES 细胞的体外诱导分化研究109

3.4.1 ES 细胞体外诱导分化为肌细胞的研究111

3.4.2 ES 细胞体外定向分化为神经元和神经胶质细胞112

3.4.3 胚胎干细胞定向造血细胞分化的研究115

4 由中靶细胞获得突变体动物的方法126

4.1 通过囊胚显微注射法获得嵌合体小鼠126

4.1.1 小鼠的饲养和管理126

4.1.2 供体囊胚的制备128

4.1.3 囊胚的显微注射130

4.1.4 胚胎移植132

4.1.5 嵌合体的鉴定和传代134

4.1.6 基因打靶突变小鼠的维持136

4.2 通过胚胎聚合法获得完全 ES 细胞来源的胚胎或嵌合体小鼠138

4.2.2 聚合用胚胎的准备139

4.2.1 用于胚胎聚合的 ES 细胞的准备139

4.2.3 ES 细胞与胚胎的聚合144

4.2.4 聚合体胚胎的培养和转移147

4.2.5 剖腹产147

4.2.6 二倍体或四倍体嵌合体胚胎的鉴定147

4.2.7 完全 ES 细胞来源胚胎及嵌合体胚胎的应用和前景148

5 基因打靶在现代生物学研究中的应用实例153

5.1 应用基因剔除技术研究 Smads 基因的功能153

5.1.1 SMADs 的结构及分类154

5.1.2 SMADs 介导的信号转导156

5.1.3 用基因剔除技术研究 Smads 基因在脊椎动物体内的功能158

5.1.4 小结162

5.2 葡萄糖激酶基因剔除及成年型糖尿病模型165

5.2.1 MODY 的研究概况165

5.2.2 葡萄糖激酶基因166

5.2.3 MODY 的动物模型及葡萄糖激酶基因剔除168

5.3 人类疾病的基因打靶小鼠模型172

5.3.1 小鼠基因组学研究进展172

5.3.2 小鼠模型的发展及特性174

5.3.3 基因打靶小鼠作为人类疾病动物模型的研究175

5.3.4 基因打靶小鼠作为人类疾病模型的问题与展望182

5.4 核移植法研制突变体动物184

5.4.1 生产突变体动物的传统方法185

5.4.2 核移植方法的发展过程186

5.4.3 影响核移植效率的因素及存在的问题187

5.4.4 近期核移植的进展188

5.4.5 基因打靶与核移植技术相结合的优势190

5.4.6 基因打靶与核移植技术相结合的应用前景191

6 基因打靶技术存在的问题及对策195

6.1 打靶载体设计引起的问题195

6.1.1 不完全剔除195

6.1.2 其他基因编码区或者调控元件的删除196

6.1.3 筛选标记基因对表型的影响197

6.2 表型解释中存在的问题198

6.2.1 基因冗余和代偿机制198

6.2.2 遗传背景对小鼠表型的影响200

6.2.3 修饰基因对表型的影响及应用202

6.2.4 亚效等位基因204

6.3 关于解决基因打靶研究中存在问题的建议205

6.4 总结206

7.1 靶基因 cDNA 探针的克隆210

7 附录1 常用实验方法210

7.2 靶基因基因组 DNA 片段的筛选和克隆211

7.2.1 从小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库中筛选基因组 DNA 片段211

7.2.2 从小鼠基因组噬菌体文库中筛选基因组 DNA 片段216

7.3 Northern 杂交分析220

7.3.1 组织和细胞总 RNA 的提取220

7.3.2 在含甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳220

7.3.3 将 RNA 转移至硝酸纤维素膜并进行杂交221

7.3.4 采用 mRNA 膜进行 Northern 杂交222

7.4 小鼠的基因型分析222

7.4.1 从鼠尾提取基因组 DNA222

7.4.2 采用 PCR 法鉴定小鼠的基因型223

7.4.3 小鼠早期胚胎的基因型鉴定224

7.5 常规组织学分析：苏木素-伊红染色225

7.5.1 石蜡标本的包埋225

7.5.2 石蜡切片225

7.5.3 苏木素和伊红染色液的配制225

7.5.4 常规石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色程序226

7.6 免疫组化分析226

7.7 普通原位杂交227

7.7.1 35S 标记的单链 RNA 探针的制备和纯化227

7.7.2 组织切片的处理及原位杂交228

7.7.3 漂洗和曝光229

7.7.4 乳胶曝光和显影230

7.8 整体原位杂交230

7.8.1 地高辛(DIG)标记的 RNA 探针的制备230

7.8.2 胚胎的固定231

7.8.3 胚胎的预处理和杂交231

7.8.4 漂洗和抗体标记232

7.8.5 显色反应232

7.9 小鼠的全骨架制备233

7.11.1 组织切片的 lac Z 染色234

7.11 小鼠组织的 lac Z 染色234

7.10 利用藏红 O 染色检测小鼠骨切片中蛋白多糖的含量234

7.11.2 整体胚胎的 lac Z 染色235

8 附录2 常用溶液和缓冲液的配制236

8.1 常用试剂的配制236

8.2 杂交试验中用于降低背景的封闭液241

8.3 蛋白水解酶类242

8.4.2 M2溶液的配制243

9 附录3 常用参考书和数据库243

8.4.1 贮存液成分243

8.4 M2和 M16溶液的配制243

8.4.3 M16溶液的配制244

9.2 常用基因打靶和转基因小鼠资源网站245

9.2.1 主要数据库精选245

9.2.2 遗传工程突变体小鼠246

9.1 常用参考书248

9.2.3 特定小鼠品系248

9.2.4 ENU 诱变数据库249

9.2.5 基因打靶操作手册249

9.2.6 乳腺转基因数据库250

9.2.7 商业和其他供应者250

后记251