RNA研究方法 导读版 原著第4版 英文2025|PDF|Epub|mobi|kindle电子书版本百度云盘下载

RNA研究方法 导读版 原著第4版 英文PDF格式电子书版下载

注意：本站所有压缩包均有解压码： 点击下载压缩包解压工具

1重温RNA和细胞生物化学1

为什么研究RNA？1

RNA是什么？2

多核苷酸的装配5

RNA的种类8

转录和中心法则10

研究转录的重要动植物模型11

启动子和调控元件12

基因和基因组的组织影响转录14

RNA聚合酶和转录产物18

信使RNA22

典型的mRNA分子的拓扑学23

5＇帽23

引导序列25

编码区25

尾随序列26

多聚A尾26

细胞器mRNA28

mRNA的稳定性、转运和转归29

双顺反子mRNA30

原核mRNA30

mRNA的序列和结构影响翻译31

基因调控的水平32

来自单基因座的mRNA的可变剪接34

反式剪接：mRNA的修复35

小RNA综观36

微小RNA对基因表达的调控37

参考文献38

2分离RNA的策略45

概述45

纯化RNA过程中的目标47

裂解缓冲液配方49

温和的裂解缓冲液49

方案：用低渗裂解分离胞质RNA51

离液性裂解缓冲液56

用含胍的缓冲液分离RNA57

胍-酸-酚抽提技术58

方案：胍-酸-酚抽提59

密度梯度离心60

氯化铯61

方案：氯化铯梯度61

三氟乙酸铯65

方案：三氟乙酸铯梯度65

同时分离RNA和DNA68

方案：同时分离RNA和DNA69

说说试剂盒71

硅胶的技术72

用硅胶柱分离胞质RNA73

亲和介质73

其他方法74

方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA74

方案：分离原核RNA75

方案：分离酵母RNA76

提纯的RNA的短期和长期保存78

参考文献79

3关于组织的真相81

概述81

组织培养物还是组织？81

细胞培养的优点82

组织样品的优点83

匀浆法84

用Polytron捣碎84

用Dounce匀浆器匀浆86

BeadBeaterTM技术87

各种器官和组织的RNA分离的策略87

新鲜组织89

冻存组织90

固定的组织91

方案：分离组织RNA的LiCl-尿素法92

方案：从富含类脂样品分离RNA95

与聚核糖体结合的mRNA的提纯96

方案：聚核糖体mRNA的分离98

在野外收集样品99

RNA“清洗”法100

从组织分离RNA的困难解决101

参考文献102

4走向绿色：植物RNA及其分子生物学105

概述105

RNA的分离和植物的怪异点105

植物细胞产生的RNA的种类109

方案：从叶中分离RNA110

方案：从树皮中分离RNA112

方案：从果实中分离RNA113

从其他植物组织分离RNA的策略115

从植物组织分离RNA的困难解决116

参考文献和建议阅读117

5带PolyA尾的RNA的分离121

概述121

加PolyA尾122

利用Poly （A）时的注意事项123

例1124

例2124

选择带PolyA尾的分子126

用于提纯Poly （A）+的磁珠技术127

Oligo （dT）-纤维素柱层析129

方案：大量Poly （A）+RNA的提纯130

不用柱的快速Poly （A）+提纯135

方案：不用柱的Poly （A）+提纯135

参考文献136

6 RNA制品的质量控制139

概述139

质控技术1：紫外分光光度法和光吸收比140

分光光度法140

核酸浓度的测定141

核酸纯度的测定143

非分光光度法145

质控技术2：RNA的电泳图147

方案149

质控技术3：紫外光投影150

方案151

质控技术4：样品支持RT-PCR的能力152

质控技术5：Northern分析153

质控技术6：样品支持体外翻译的能力153

参考文献154

7棘手的核糖核酸酶155

概述155

核糖核酸酶活力的去除156

潜伏的RNase污染问题157

核糖核酸酶抑制剂的种类158

专一抑制剂158

氧钒核糖核苷络合物158

RNasin？159

非专一抑制剂160

仪器和试剂的准备161

焦碳酸二乙酯162

代替剂：灭菌水164

过氧化氢164

氢氧化钠和十二烷基硫酸钠165

控制核酸酶活力用的其他试剂165

盐酸胍165

硫氰酸胍165

十二烷基硫酸钠166

N-十二烷基肌氨酸166

酚：氯仿：异戊醇166

8-羟基喹啉167

氯化铯167

三氟乙酸铯168

蛋白酶K168

“RNAlater”（商品名）169

方案：氧钒核糖核苷络合物的合成169

参考文献170

8严谨度：影响核酸结构的条件173

双链分子的种类173

控制严谨度的重要性174

盐对严谨度的影响176

pH对严谨度的影响176

温度对严谨度的影响177

甲酰胺对严谨度的影响177

尿素对严谨度的影响177

参考文献178

9 RNA电泳179

概述179

核酸的标准化180

方案：Poly （A）的标准化183

样品制备183

琼脂糖凝胶电泳的RNA变性系统185

甲醛变性187

方案：甲醛变性胶188

尿素变性189

方案：尿素变性191

乙二醛、二甲基亚砜变性191

方案：RNA的乙二醛化和电泳192

用非变性胶跑RNA电泳194

分子量标准194

分子大小标准的恰当应用195

核糖体RNA197

凝胶染色技术204

溴乙锭204

SYBR绿207

SYBR金207

安全SYBR208

“GelStar”染色剂209

银染色209

吖啶橙210

亚甲基蓝210

安全考虑和仪器维护212

第一次跑琼脂糖电泳：一些提示213

基本词汇表213

要牢记的几点213

参考文献216

10照相记录和影像分析221

概述221

安全第一222

数字影像分析223

影像格式228

实际的考虑229

适用于任何预算的数字影像分析231

影像分析学习班232

磷屏显像仪232

传统的照相记录方法233

样品显影234

滤光234

将电泳图谱最优化的几点提示235

照相底片和X光片的内在局限性238

参考文献和建议阅读239

11 Northern分析241

概述241

滤膜的选择242

硝酸纤维素膜243

尼龙膜244

聚偏二氟乙烯膜245

处理和滤膜准备245

Northern转移技术246

毛细现像转移246

“TurboBlotter”转移器247

负压转移248

电转移249

碱性转移249

方案：利用被动的毛细扩散转移RNA250

方案：用TurboBlotter向下转移RNA252

滤膜转移后的处理254

甲醛变性系统254

乙二醛变性系统254

选择1254

选择2255

固定化技术255

烘烤255

紫外光交联256

方案：用紫外光把RNA交联在尼龙膜上257

滤膜固定后的处理257

逆Northern分析258

参考文献259

12核酸探针技术261

概述261

探针的分类263

选择标记系统263

同位素标记265

尽可能避免分解问题266

非同位素标记267

通用染料Cy3和Cy5267

常用的化学发光方式268

生物素268

洋地黄苷原270

荧光素271

直接酶标记271

DNA探针272

DNA探针的合成273

聚合酶链式反应274

随机引物反应274

缺口转移274

5＇末端标记275

3＇末端标记275

反义RNA探针276

RNA探针的特征278

RNA探针的合成278

体外转录278

5＇末端标记279

3＇末端标记279

探针的纯化279

探针的保存280

参考文献281

13核酸杂交的实践283

概述283

影响杂交动力学和双链稳定性的因素284

温度285

离子强度286

pH287

探针长度287

探针浓度287

G+C含量288

错配288

探针复杂度289

粘度289

甲酰胺290

尿素290

杂交温度291

长探针的熔点温度291

寡核苷酸探针的熔点温度292

杂交和Northern分析292

预杂交：滤膜的准备293

方案：长探针预杂交293

探针变性294

杂交295

杂交后的严谨度洗涤295

除去探针和重杂交296

方案：除去探针的通用方法297

参考文献298

14检出的原理301

概述301

放射自显影302

滤膜的处理304

X光片305

安全灯306

曝光时间306

增感屏307

荧光显影308

胶片预闪光309

片匣的种类309

显影和定影310

方案：放射自显影310

非同位素方法312

生物素313

洋地黄苷原313

荧光显影314

直接酶标314

用化学发光检出314

化学发光的底物315

显色检出方法317

数字影像系统318

参考文献320

15用抗核酸酶技术定量特定的mRNA321

概述321

基本方法322

探针的选择327

最优化建议329

潜在困难330

方案：用S1核酸酶分析定量转录物332

方案：用抗核糖核酸酶检验定量转录物335

困难解决337

参考文献338

16核RNA的分析341

概述341

转录速率的检验343

与稳态RNA研究的关系346

核Run-off与核Run-on检验347

方案：核Run-off检验348

细胞的收获和细胞核的制备349

制备易破细胞核的另一方法349

从整块组织制备细胞核的另一方法350

转录物的标记和回收351

靶DNA的制备353

杂交用RNA的制备354

杂交后的洗涤和检出355

方案：核Run-off检验的另一方法356

方案：抗核酸酶检验-脉冲标记转录检验357

区分各种RNA聚合酶的活力359

提取核RNA用于稳态分析360

方案：直接分离核RNA361

方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA362

核RNA分析的困难解决363

参考文献364

17 cDNA合成367

概述367

cDNA合成——概论368

合成第一链的考虑369

逆转录酶的选择372

合成第二链的考虑375

经典方法376

基于PCR的方法377

方案：第一链cDNA合成377

评估cDNA合成的效率379

克隆cDNA379

连接的考虑381

用于连接的酶383

应用383

参考文献384

18逆转录PCR：一种科学和技术形式385

概述385

PCR——概论386

逆转录PCR一般研究391

PCR样品间沾染的防止395

实验室的设计395

程序方法396

阻挡气溶胶的窍门397

尿嘧啶-N-糖苷酶398

引物设计398

基本规则402

Tm的考虑406

估计Tm406

Tm的精确计算407

网上资源407

多重引物的设计407

最优化手续408

热稳定聚合酶411

正对照413

负对照413

热启动PCR413

锁定的核酸415

降落PCR416

内对照416

关于转录调控419

PC R产物的分析420

逆转录PCR质量控制的注意点421

验证来自PCR的数据的非PCR方法423

相关技术424

5＇ RACE PCR424

5＇ RLM-RACE426

3＇ RACE-PCR426

巢式PCR428

长距离PCR429

单细胞PCR431

发夹式接头PCR433

猎取可变转录起始位点434

方案：第一链cDNA合成435

方案：cDNA的PCR扩增436

克隆PCR产物437

方案：把平头PCR产物加A尾438

方案：TA克隆的连接反应438

“拓扑”克隆440

其他扩增方法441

RNA的线性扩增（Eberwine过程）441

链替换扩增442

基于核酸序列的扩增（NASBA）443

连接酶链式反应443

参考文献443

19定量PCR技术449

概述449

灵敏度指数450

定量研究451

实时PCR453

实时PCR平台456

SYBR绿检验457

TaqMan？检验458

分子信标458

“LUX”牌引物460

“蝎子”引物461

熔点曲线分析462

内对照463

外对照463

对照反应的设置方式467

负对照的考虑471

竞争PCR：关键的考虑472

竞争PCR：所包括的主要步骤477

另一方法：非实时竞争PCR479

方案：竞争PCR480

非同源竞争物的合成480

第1链cDNA的合成481

竞争PCR（一级扩增）482

竞争PCR（二级扩增）484

影像分析的考虑485

定量PCR技术的困难解决486

参考文献488

20功能基因组学和转录物总体分析491

概述491

功能基因组学的定义491

功能基因组学研究方法的重要性492

常用的功能基因组学研究方法493

功能基因组学和经典分子生物学496

21基因表达的高通量分析499

概述499

什么是微阵列？500

什么是热图？502

微阵列能做什么？504

微阵列不能做什么？504

微阵列分析的主要步骤507

参考RNA509

宏阵列是什么？510

应用512

参考文献512

22整体分析基因表达的非阵列方法515

概述515

基本问题516

消减方法517

抑制性消减杂交（SSH）517

困难解决524

非消减方法526

mRNA差别显示526

各种方案529

参考文献536

23 RNA干扰：Dicer酶在RISC复合物中起作用539

概述539

RNAi的基本名词541

RNA干扰——它如何工作542

siRNA方法545

shRNA方法546

将siRNA导入哺乳动物细胞的方法548

miRNA549

siRNA的有效设计550

RNAi和转录物可变剪切552

体外和体内问题553

RNAi的确认555

RT-PCR方法556

Northern杂交分析556

Western杂交分析556

应用557

参考文献557

24基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学561

概述561

基本名词563

基因组和基因组学564

转录组和转录组学565

蛋白质组和蛋白质组学566

生物信息学571

搜索基因——BLAST一下！571

参考文献573

25 RNA一例575

一个典型实验？577

灵敏度问题580

下一步做什么580

到哪儿去求助582

尾声585

几粒智慧之珠585

附录A保留完整准确的记录591

附录B把质量转换为摩尔593

附录C对分子生物学家有用的储存液597

附录D酚的制备603

附录E溴乙锭和SYBR绿溶液的弃去607

附录F用DNase Ⅰ从RNA样品中除去DNA611

附录G用RNase保温从DNA样品中除去RNA613

附录H甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子615

附录I硅化离心管和玻璃器具617

附录J贴壁细胞的胰酶处理方案619

附录K盐析法分离高分子量DNA621

附录L电泳：原理、参数和安全625

附录M聚丙烯酰胺凝胶电泳637

附录N点杂交分析641

附录O离心是分子生物学家的主流工具649

附录P仪器和试剂供应商及服务商选登655

附录Q有用的国际单位制单位663

附录R常用缩写665

附录S商标摘录667

术语表671

索引693