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第1章 蛋白质组学导论1

1.1　蛋白质组学定义3

1.2　为何除基因组学外还要有蛋白质组学？5

1.3　蛋白质的鉴定和分析10

1.4　差异显示蛋白质组学（比较蛋白质组学）17

1.5　翻译后修饰19

1.6　蛋白质微阵列23

1.7　捕获分子和靶分子24

参考文献26

网络资源33

第2章 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳35

2.1　聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理38

2.2　SDS用于变性的聚丙烯酰胺凝胶42

2.5　非变性PAGE（自然凝胶电泳）分离天然蛋白和蛋白复合体45

2.4　三羟甲基甘氨酸SDS-PAGE分离小分子多肽45

2.3　乙酸－尿素PAGE根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质45

实验方案47

方案1　蛋白质的SDS-PAGE47

替代方案：用Bio-Rad 385 Gradient Former灌制线性梯度凝胶52

方案2～7的导言：蛋白质显色步骤56

方案2　传统的考马斯亮蓝染色58

方案3　快速考马斯亮蓝染色60

方案4　InstaStain Blue凝胶纸染色62

方案5　SYPRO Ruby荧光染色64

方案6　SYPRO Orange荧光染色66

方案7　与质谱兼容的银染68

方案8　表观分子量的判定70

方案9　CTAB-PAGE72

方案10　酸－尿素连续PAGE74

方案11　肽类的电泳（Tricine-SDS-PAGE）76

方案12　蛋白质的非变性PAGE78

参考文献80

网络资源82

第3章 细胞和亚细胞提取物的制备83

3.1　通过机械或化学方法破碎组织及细胞85

3.2　通过变性和复性从包含体中回收重组蛋白88

3.3　富含目的蛋白的亚细胞提取物的制备90

实验方案93

方案1　哺乳动物组织的匀浆93

附加方案：从组织匀浆液中去除黏蛋白97

方案2　用于免疫沉淀的培养细胞的裂解98

方案3　用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解100

方案4　氮舱减压法裂解培养细胞102

方案5　细菌中重组蛋白的小量提取106

方案6　细菌中重组蛋白的大量提取108

方案7　从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白110

方案8　酵母提取物的制备112

方案9　真核细胞结构组分的差异去垢剂分离法114

附加方案：去垢剂提取物中RNA的分离123

附加方案：用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白124

参考文献126

选读文献130

网络资源130

第4章 固相化pH梯度双向凝胶电泳131

4.1　双向凝胶电泳样品的制备134

4.2　第一向：固相pH梯度等电聚焦电泳138

4.3　第二向：根据分子量分离蛋白质139

4.4　双向凝胶的染色141

4.5　双向凝胶中蛋白质的转移144

4.6　双向凝胶图像的获取和分析145

方案1　双向凝胶电泳鼠肝蛋白质提取物的制备149

实验方案149

方案2　双向凝胶电泳真核生物细胞裂解物的制备151

附加方案：用放射性同位素标记真核生物细胞蛋白质152

方案3　双向凝胶电泳大肠杆菌裂解液的制备154

方案4　双向凝胶电泳脑脊液蛋白样品的制备156

方案5　第一向：蛋白质的等电聚焦电泳158

方案6　垂直SDS平板凝胶的制备：均一凝胶的灌制162

方案7　垂直SDS平板凝胶制备：同时灌制多梯度凝胶165

方案8　IPG胶条的平衡169

方案9　第二向：蛋白质的SDS-PAGE171

方案10　胶体考马斯亮蓝染色174

方案11　银氨染色176

方案12　与质谱兼容的银染法180

方案13 用SYPRO Ruby进行荧光染色183

方案14　用GelCode磷蛋白染色试剂盒对磷蛋白进行染色185

方案15　双向凝胶的槽式转移187

方案16　双向凝胶的半干印迹190

方案17～20的导言：膜上蛋白质的染色192

方案17　用丽春红S染色膜上的蛋白质193

方案18　用考马斯亮蓝R250染色膜上的蛋白质194

方案19　用印度墨水染色膜上的蛋白质195

方案20　用胶体金染色膜上的蛋白质196

网络上有关双向电泳的信息资源197

参考文献200

第5章　反相高效液相色谱203

5.1　RP-HPLC基于疏水相互作用分离分子204

5.2　RP-HPLC标准色谱条件205

5.3　微柱反相色谱——适合蛋白质组学的研究方法213

实验方案219

方案1　蛋白质RP-HPLC的标准色谱条件219

方案2　填充RP-HPLC毛细管微柱224

方案3　不易分离的大分子量多肽的纯化231

方案4　用RP-HPLC对固相合成的多肽进行纯化238

方案5　用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐244

方案6　计算机辅助方法优化梯度条件的RP-HPLC蛋白质分离248

参考文献258

选读文献263

网络资源263

第6章 蛋白质氨基端及羧基端序列分析265

6.1　Edman降解法对多肽进行氨基端测序267

6.2　限制序列分析速度的几个环节275

6.3　应用HPLC和PAGE制备微量测序样品279

6.4　不能进行测序的蛋白质需去封闭282

6.5　磷酸化位点的微量测序分析有助于绘制信号途径283

6.6　固相测序仪是回收磷酸化氨基酸的最好方法283

6.8　羧基端测序方法存在的问题284

6.7　其他氨基端反应法284

6.9　自动化羧基端测序285

6.10　高灵敏度高效率的羧基端分析285

6.11　氨基端和羧基端序列组合分析289

实验方案291

方案1　两相柱测序仪的样品上样291

方案2　将蛋白质从凝胶电转移至PVDF膜293

方案3　检测PVDF膜上的蛋白质297

方案4　浓缩聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质点299

方案5　磷酸化多肽的固相微量测序302

方案6　羧基端序列分析304

单位换算指南307

参考文献309

选读文献312

网络资源313

第7章 电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析315

7.1　制备肽谱的微量方法和大规模方法318

7.2　消除蛋白质分子内部的共价交联以提高肽谱质量319

7.3　酶法和化学法裂解多肽链323

7.4　基于SDS-PAGE的肽谱制备方法（Cleveland法）333

7.5　肽谱用于确定蛋白质中的二硫键334

7.6　应用RP-HPLC制备肽谱335

实验方案339

方案1　蛋白质的过甲酸氧化339

方案2　蛋白质还原和S－羧甲基化：大规模方法341

方案3　蛋白质还原和S－羧甲基化：微量方法344

方案4　用Ellman试剂测定自由巯基和二硫键347

方案5　蛋白质的胰酶消化349

附加方案：用琥珀酸酐修饰赖氨酰侧链351

附加方案：用柠檬酸酐修饰赖氨酰侧链352

方案6　用溴化氰切割Met-X键353

方案7　用羟胺切割Asn-Gly键355

方案8　邻亚碘酰苯甲酸在色氨酸处切割357

方案9　胶内蛋白质的考马斯亮蓝染色359

方案10　胶内蛋白质的锌／咪唑负染色361

方案11　胶内蛋白质的硝酸银染色363

方案12　胶内蛋白质的S－吡啶乙基化365

方案13　胶内蛋白质的酶解和肽段提取367

方案14　电印迹膜上的蛋白质消化369

方案15　标准条件下肽段的反相HPLC372

方案16　SDS-PAGE肽谱作图方法（Cleveland法）378

方案17　原位SDS-PAGE肽谱作图方法（Cleveland法）380

蛋白酶和肽酶命名法383

参考文献384

选读文献390

网络资源390

第8章　质谱在蛋白质组学中的应用391

8.1　基本原理393

8.2　现代离子化方法：离子如何形成400

8.3　串联质谱仪405

8.4　串联质谱仪的质量分析器结构407

8.5　质谱与蛋白质分离方法联用进行蛋白质混合物的分离和分析412

8.6　体内及体外标记方法：质谱用于定量和表达蛋白质组学426

8.7　利用MS数据鉴定蛋白质的搜索引擎427

8.8　总结436

实验方案437

方案1　蛋白质和多肽MALDI-MS分析的一般方法437

方案2　反相微型层析柱的制备441

方案3　固定化酶微型层析柱的制备444

方案4　用于蛋白质组分析的微毛细管HPLC色谱及ESI一体化装置的制备和使用446

方案5　利用Nano-LC耦联MS/MS分析复杂蛋白质混合物455

方案6　利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋白质混合物466

附加方案：用于MuDPIT分析的不溶性蛋白样品的消化470

方案7　二维色谱和质谱结合分离多肽混合物：离线方法472

方案8　通过肽的半胱氨酰化捕获蛋白质477

方案9　蛋白质的同位素亲和标签480

方案10　定量蛋白质组学的体内蛋白质同位素标记488

方案11　利用脱水胰酶亲和捕获蛋白质494

方案12　应用分子扫描器进行蛋白质组分析498

方案13　利用化学印刷法进行肽质量指纹图谱分析508

利用MS/MS进行“自上而下”的蛋白质序列分析517

气相质子化肽段的裂解机理525

参考文献532

网络资源542

第9章 用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱543

9.1　完整磷酸化蛋白的检测和分析547

9.2　通过蛋白质的裂解获得磷酸化蛋白多肽549

9.3　用MS或MS/MS来确定磷酸化蛋白的特性549

9.5　对磷酸化蛋白特征进行分析的多维策略563

9.4　用MS/MS对磷酸化多肽进行测序563

9.6　用于磷酸化多肽序列分析的MS和MS/MS技术的出现564

9.7总结565

实验方案566

方案1　用带有Fe（Ⅲ）和Ga（Ⅲ）的IMAC纯化磷酸化多肽566

附加方案：用于样品去盐的微柱和Nanoscale IMAC的制备和使用569

方案2　在MALDI分析之前或之后对磷酸化多肽进行碱性磷酸酶处理570

方案3　结合固定化金属离子亲和介质和MALDI-TOF-MS直接分析方法对磷酸化多肽进行特征分析573

方案4　离线micro-IMAC富集磷酸化蛋白579

方案5　用μLC-ESI-MS/MS对磷酸化多肽进行分析582

方案6　MALDI-MS确定酪氨酸磷酸化位点584

方案7　用ESI-MS确定丝氨酸、苏氨酸的磷酸化位点590

附加方案：用放射性磷酸盐确定自发磷酸化位点594

方案8　用ESI-MS确定组氨酸磷酸化位点596

参考文献599

网络资源605

第10章 蛋白质复合体性质的研究607

10.1　mRNA的选择性剪接对蛋白质产物活性的特定影响609

10.2　用相互作用组描述生理复合体609

10.3　利用酵母双杂交分析与蛋白质组学方法研究蛋白质间相互作用611

10.4　用亲和捕获技术分析蛋白质相互作用612

10.5　了解多蛋白质复合体的结构618

10.6　FRET分析体内蛋白质相互作用623

10.7　通过测定结合常数来分析蛋白质间相互作用626

10.8　蛋白质微阵列促进大规模的蛋白质研究627

实验方案634

方案1　用FLAG抗原表位标记蛋白质进行蛋白质免疫共沉淀634

方案2　细胞裂解液中相互作用蛋白的亲和纯化640

方案3　多蛋白质复合体的非变性琼脂糖凝胶电泳645

方案4　BN-PAGE蛋白质分析法649

方案5　采用交联法和质谱法对蛋白质复合体进行拓扑学分析657

方案6　亚秒级光交联：用水溶性金属复合体监控蛋白质－蛋白质相互作用665

方案7　位点特异性蛋白质－DNA光交联法：分析蛋白质－DNA和多蛋白质－DNA复合体的结构组成671

方案8　用FRET法分析体内蛋白质的相互作用685

方案9　用GFP嵌合体监控蛋白质－蛋白质相互作用694

方案10　蛋白质阵列：显微镜玻片的制备699

方案11　蛋白质阵列：标记蛋白并通过阵列检测来研究蛋白质蛋白质相互作用702

附加方案：如何防止产生拖尾705

方案12　蛋白质阵列：标记复合体并通过阵列检测来研究蛋白质－小分子相互作用706

方案13　蛋白质阵列：阵列的探针标记方法及激酶－底物相互作用的放射性印迹检测709

方案14　蛋白质阵列：用“三明治法”研究复合体溶液711

参考文献714

网络资源721

第11章 蛋白质组学实验结果的诠释：利用生物信息学发现蛋白质的结构、功能723

及其相互作用723

11.1　基因及其同源体的识别725

方案1　利用Gapped-BLAST对一条长肽段进行简单序列查找727

方案2　用双向最佳匹配法快速识别直源体734

11.2　预测蛋白质的结构和功能736

11.3　蛋白质在通路中的定位和蛋白质细胞功能的识别743

方案3　用基因融合假说寻找功能相关联的蛋白质——基于结构域的搜索746

方案4　操纵子的快速识别748

方案5　通过系统发育谱的比较发现功能相关联的蛋白质750

方案6　从DNA微阵列数据中发现功能相关联的蛋白质755

参考文献759

网络资源762

附录1　参考图表765

附录2　技术773

附录3　注意事项822

附录4　供应商836

索引837