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第1章 绪论1

1.1基因工程的基本概念1

1.2基因工程的研究内容2

1.3基因工程诞生的基础2

1.3.1基因工程诞生的理论基础2

1.3.2技术上的三大突破3

1.4基因工程技术的诞生3

1.5基因工程的应用5

1.5.1原核细胞基因工程5

1.5.2植物基因工程7

1.5.3动物基因工程8

1.5.4基因治疗8

1.5.5理论研究9

1.6基因工程的安全性9

1.7我国的《基因工程安全管理办法》11

思考题12

参考文献13

第2章 基因工程的基本技术14

2.1凝胶电泳技术14

2.1.1基本原理15

2.1.2琼脂糖凝胶电泳15

2.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳17

2.1.4脉冲场凝胶电泳18

2.1.5双向电泳技术20

2.1.6凝胶电泳片段的回收与纯化21

2.2分子杂交技术22

2.2.1分子杂交的原理22

2.2.2分子杂交的类型24

2.3 PCR技术26

2.3.1 PCR基本原理和反应过程26

2.3.2 PCR反应的体系及其设计和优化28

2.3.3 PCR产物的克隆31

2.3.4 PCR技术的发展及其应用36

2.4 DNA序列分析47

2.4.1 Maxam-Gibert化学降解法47

2.4.2 Sanger双脱氧链终止法49

2.4.3 DNA序列分析的自动化50

2.4.4 DNA序列的生物信息学分析52

2.5基因芯片及数据分析53

2.5.1基因芯片概念54

2.5.2技术原理54

2.5.3基因芯片的制备54

2.5.4基因芯片的应用55

2.6研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法57

2.6.1酵母单杂交系统（可延伸双杂交）57

2.6.2凝胶阻滞试验（Gel-shift）57

2.6.3 DNaseⅠ足迹法58

2.6.4噬菌体展示技术58

思考题59

参考文献59

第3章 基因工程的工具酶61

3.1限制性内切核酸酶62

3.1.1限制性内切核酸酶的发现与种类62

3.1.2限制性内切核酸酶的命名63

3.1.3Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性63

3.1.4影响限制性内切核酸酶活性的因素66

3.1.5限制性内切核酸酶酶切DNA的方法68

3.2 DNA连接酶68

3.2.1 DNA连接酶的发现68

3.2.2 DNA连接酶的种类69

3.2.3黏性末端DNA片段的连接69

3.2.4平末端DNA片段的连接71

3.2.5影响连接反应的因素73

3.3 DNA聚合酶和反转录酶74

3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其应用75

3.3.2 E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶及其应用76

3.3.3T4噬菌体DNA聚合酶77

3.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶77

3.3.5反转录酶78

3.4修饰酶类79

3.4.1末端脱氧核苷酸转移酶79

3.4.2T4多核苷酸激酶79

3.4.3碱性磷酸酶79

3.5其他工具酶80

3.5.1 S1核酸酶80

3.5.2 Bal 31核酸酶81

3.5.3核酸外切酶82

3.5.4 RNA酶83

思考题84

参考文献84

第4章 基因工程的克隆载体85

4.1质粒载体86

4.1.1质粒的一般生物学特性86

4.1.2质粒DNA的复制与拷贝数的控制89

4.1.3质粒DNA的分离与纯化91

4.1.4质粒载体的构建及类型92

4.1.5重要的大肠杆菌质粒载体95

4.1.6质粒载体的稳定性问题99

4.2噬菌体载体100

4.2.1噬菌体的一般生物学特性100

4.2.2 λ噬菌体载体103

4.2.3单链DNA噬菌体载体107

4.3柯斯质粒载体112

4.3.1柯斯质粒载体的构建及其特点112

4.3.2柯斯克隆113

4.3.3柯斯克隆的改良114

4.4噬菌粒载体116

4.4.1噬菌粒载体的概念116

4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体117

4.4.3 pBluescript噬菌粒载体118

4.5人工染色体克隆载体119

4.5.1构建大容量载体的必要性119

4.5.2人工染色体的必需成分120

4.5.3酵母人工染色体载体120

4.5.4细菌人工染色体载体122

4.5.5 P1人工染色体123

4.5.6人类人工染色体123

4.5.7植物人工染色体124

思考题124

参考文献125

第5章 目的基因的获取与改造126

5.1 DNA的人工合成126

5.1.1人工合成DNA的原理126

5.1.2人工合成DNA的应用128

5.2从基因文库获取目的基因130

5.2.1基因组文库的构建与筛选130

5.2.2 cDNA文库的构建与筛选136

5.2.3基因组文库与cDNA文库的区别140

5.3 PCR技术与目的基因的分离141

5.3.1目的基因的直接扩增和克隆141

5.3.2目的基因的cDNA的克隆141

5.4电子克隆获取目的基因141

5.4.1电子克隆的基本原理142

5.4.2利用EST数据库进行电子克隆142

5.4.3利用基因组数据库进行电子克隆143

5.4.4全长cDNA的判断143

5.5根据基因差异表达获得目的基因143

5.5.1 mRNA差异显示技术143

5.5.2 cDNA代表性差异分析145

5.5.3抑制差减杂交技术145

5.6目的基因的改造147

5.6.1基因突变与人工诱变技术147

5.6.2基因定点诱变149

5.6.3基因随机突变151

思考题153

参考文献153

第6章 目的基因的导入与重组体的鉴定155

6.1重组DNA向原核细胞的导入155

6.1.1原核受体细胞的种类及特点155

6.1.2转化156

6.1.3重组质粒DNA分子转化大肠杆菌157

6.1.4重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌160

6.2重组DNA导入真核细胞161

6.2.1真核受体细胞161

6.2.2重组DNA分子导入酵母细胞162

6.2.3重组DNA分子导入植物细胞162

6.2.4重组DNA分子导入哺乳动物细胞164

6.3重组体克隆的筛选与鉴定167

6.3.1载体遗传标记筛选法167

6.3.2依赖于重组子结构特征分析的筛选法171

6.3.3核酸分子杂交检测法172

6.3.4免疫化学检测法174

6.3.5翻译筛选法175

6.3.6亚克隆法176

6.3.7插入失活法176

6.3.8电子显微镜作图检测法177

6.3.9转录产物作图177

6.3.10基因表达产物分析法177

6.3.11 DNA序列测定法178

思考题179

参考文献179

第7章 外源基因的原核表达系统180

7.1原核表达系统的特点180

7.1.1原核生物的转录180

7.1.2原核生物的翻译181

7.2原核细胞表达体系182

7.2.1大肠杆菌表达体系182

7.2.2芽孢杆菌表达体系185

7.2.3链霉菌表达体系186

7.2.4蓝藻表达体系188

7.3提高外源基因表达水平的措施190

7.3.1优化表达载体的设计190

7.3.2避免使用稀有密码子190

7.3.3提高外源基因mRNA的稳定性190

7.3.4提高表达蛋白的稳定性，防止其降解191

7.3.5减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平191

7.3.6优化发酵条件191

7.4利用原核细胞生产真核蛋白质的实例191

7.4.1干扰素基因工程191

7.4.2生长激素基因工程192

7.4.3生长激素释放抑制因子基因工程193

7.4.4胰岛素基因工程194

7.4.5 α-淀粉酶基因工程195

7.5目的蛋白的纯化197

7.5.1组氨酸标签197

7.5.2 GST-标签198

7.5.3 MBP标签199

7.5.4 IMPACT199

7.5.5 TAP-标签200

思考题201

参考文献201

第8章 外源基因的真核表达系统202

8.1真核细胞表达体系的特点202

8.1.1利用真核细胞作宿主系统的优点202

8.2酵母表达系统203

8.2.1酵母基因表达载体的构成203

8.2.2酵母基因表达载体的种类204

8.2.3酵母基因表达系统宿主菌207

8.2.4在酵母中高效表达外源基因的策略207

8.3昆虫或昆虫细胞表达体系208

8.3.1以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系209

8.3.2杆状病毒表达系统的效率与加工能力209

8.3.3一类稳定转化的昆虫表达系统211

8.4哺乳动物细胞基因表达系统212

8.4.1哺乳动物基因表达载体的组成特征213

8.4.2哺乳动物基因表达载体214

8.4.3哺乳动物基因表达宿主细胞220

8.4.4提高哺乳动物基因表达系统表达效率的因素221

思考题221

参考文献222

第9章 转基因动物223

9.1转基因动物发展简史223

9.2转基因动物技术225

9.2.1外源基因导入动物细胞的方法225

9.2.2转基因动物技术的新发展234

9.3转基因动物的制备和检测240

9.3.1以显微注射小鼠为例介绍转基因动物的制备240

9.3.2转基因的鉴定和表达水平检测241

9.4转基因动物研究中出现的问题及其对策243

9.4.1转基因动物效率极低243

9.4.2难以控制转基因在寄主基因组的行为244

9.4.3大部分转基因表达水平极低244

9.4.4转基因表达特征及提高转基因表达的策略245

9.5转基因动物的应用246

9.5.1在生产和生活中的应用246

9.5.2在生物制药方面的应用——动物生物反应器247

9.5.3在疾病研究中的应用249

9.5.4在基础研究中的应用250

9.6转基因动物的安全性及其未来250

9.6.1食品安全性251

9.6.2环境安全性251

思考题252

参考文献252

第10章 转基因植物254

10.1转基因植物概述254

10.2转基因植物的基因转化方法255

10.2.1转基因植物受体系统255

10.2.2农杆菌介导的植物基因转化技术256

10.2.3 DNA直接导入的基因转化技术262

10.2.4花粉管通道法介导的基因转化技术264

10.3转基因植物的检测方法265

10.3.1基于报告基因/选择标记基因的转基因植物检测方法265

10.3.2基于报告基因的转基因植物的外源基因表达检测266

10.3.3外源目的基因整合的鉴定267

10.4抗虫转基因植物268

10.4.1来源于微生物的抗虫基因268

10.4.2来源于植物的抗虫基因的应用270

10.5抗细菌转基因作物272

10.5.1裂解细菌细胞壁272

10.5.2破坏细菌细胞膜273

10.5.3解除细菌毒素的毒性作用274

10.5.4引入对细菌毒素不敏感的靶酶274

10.5.5增强植物本身的防卫蛋白合成274

10.6抗病毒转基因作物275

10.6.1利用非病毒来源的抗病毒基因策略275

10.6.2利用病毒来源基因的抗病毒策略276

10.7抗除草剂转基因作物279

10.7.1增加靶标酶或靶标蛋白的拷贝数279

10.7.2作用靶标酶的修饰279

10.7.3分离能解除除草剂毒性的酶基因280

10.7.4新型除草剂的发展方向280

10.8抗逆境转基因作物280

10.8.1抗干旱胁迫策略280

10.8.2抗寒冻胁迫策略281

10.8.3抗盐碱胁迫策略282

10.9植物生物反应器282

10.9.1植物生物反应器的优点282

10.9.2植物生物反应器的研究现状283

10.9.3植物生物反应器存在的问题283

10.10转基因沉默的原因及对策284

10.10.1转基因沉默的原因284

10.10.2控制转基因沉默的策略285

10.11转基因植物的安全性评价285

10.11.1转基因植物食品的安全性评价286

10.11.2转基因植物生态环境的安全性评价288

思考题290

参考文献290

第11章 基因治疗291

11.1基因治疗的基本概念291

11.2基因治疗的发展简史与现状291

11.3基因治疗的策略294

11.3.1根据基因导入体内的方式294

11.3.2根据导入基因发生作用的方式295

11.4基因治疗的流程295

11.4.1目的基因的准备295

11.4.2靶细胞295

11.4.3载体的选择295

11.4.4转移技术296

11.5基因治疗的应用304

11.5.1肿瘤的基因治疗305

11.5.2单基因病的基因治疗312

11.5.3艾滋病等感染性疾病的基因治疗315

11.6基因治疗的前景316

11.6.1基因治疗面临的问题和挑战316

11.6.2基因治疗的发展方向317

思考题317

参考文献317

第12章 合成生物学与基因工程319

12.1合成生物学319

12.1.1合成生物学的定义319

12.1.2合成生物学的研究内容320

12.1.3合成生物学的工程本质325

12.1.4合成生物学的意义327

12.1.5合成生物学的应用328

12.2合成生物学与基因工程331

12.2.1合成生物学与基因工程的差异332

12.2.2合成生物学与基因工程相似之处333

思考题334

参考文献334

附录 总复习题335