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第一章 免疫组织化学组织细胞材料的准备1

第一节　组织的取材1

一、动物的致死法及取材1

二、尸体解剖的取材1

三、活检标本的取材2

四、细胞标本的制备2

第二节　组织的固定3

一、固定液的种类4

二、固定的方法7

三、固定的注意事项8

四、影响固定的因素8

第三节　组织的脱水、透明、浸蜡及包埋9

一、组织的脱水9

四、组织包埋10

三、组织浸蜡10

二、组织的透明10

第四节　组织切片11

一、载玻片的处理11

二、石蜡切片12

三、冰冻切片12

四、碳蜡切片12

参考文献13

第二章 免疫组织化学的基本技术14

第一节　抗原、抗体的基础知识14

一、抗原的概念14

二、抗原的化学结构及抗原决定簇14

三、抗原的性质15

四、抗体的概念16

五、抗体的性质和种类16

二、抗体的应用21

一、抗体的购置21

第二节　抗体的来源和应用21

第三节　抗原的暴露和修复23

一、暴露和修复抗原的原因23

二、抗原的暴露23

三、热诱导的抗原修复25

四、抗原修复的质量控制28

五、抗原修复存在的问题和克服的方法28

六、抗原修复和酶消化结合使用29

第四节 显色系统和衬染方法的选择29

一、HRP底物显色液的种类和配制29

二、HRP显示系统的增强方法32

三、碱性磷酸酶标记的NBT显色液33

四、衬染剂的选择34

参考文献35

第一节　免疫荧光组化技术的基本概念37

第三章 免疫荧光组织化学技术37

第二节　荧光素38

一、荧光染料的发展史和早期应用38

二、荧光色素41

三、可用于标记抗体的荧光素41

四、藻红蛋白42

第三节　荧光素标记抗体的方法43

一、标记方法43

二、荧光抗体的质量控制47

第四节　免疫荧光组织化学染色方法49

一、直接法49

二、间接法49

三、补体法51

四、双重免疫荧光细胞化学标记方法51

二、CSA法52

一、亲和细胞化学和级联抗体信号放大技术52

第五节　免疫荧光组织化学的几种增敏方法52

五、对照试验52

三、酶标记荧光信号放大技术55

第六节　荧光显微镜及检测方法57

一、荧光显微镜的原理57

二、荧光显微镜的部件57

三、激发方式60

四、使用荧光显微镜的注意事项60

五、荧光显微镜的维护与保养61

六、荧光显微镜标本制作要求61

七、荧光图像的记录方法61

第七节　染色标本的复染、保存及封片介质的制备62

一、免疫荧光组织化学的细胞核复染62

二、染色标本的保存62

三、封片介质的制备62

参考文献63

第四章　免疫酶组织化学技术65

第一节　概述65

第二节　酶和底物65

一、酶及其特点65

二、常用酶及其底物66

第三节　酶标记抗体法67

一、标记抗体的制备67

二、染色的基本原理68

三、染色步骤69

四、酶标记抗原法69

第四节　非标记抗体免疫酶法70

一、酶桥法70

二、PAP法71

第五节 免疫碱性磷酸酶组织化学技术75

一、间接免疫碱性磷酸酶法75

第六节　多聚螯合物酶法76

二、APAAP法76

二、EnVision法77

一、EPOS法77

三、UIP法78

四、PowerVision法78

参考文献79

第五章　亲和免疫组织化学技术81

第一节　亲和素与生物素系统81

一、生物素81

二、亲和素81

三、链霉亲和素82

四、基本原理82

五、操作流程82

二、酪胺化试剂的制备85

三、染色步骤85

一、基本原理85

第二节　CSA法85

四、敏感性和存在的问题87

五、使用CSA技术的技巧88

第三节　葡萄球菌A蛋白（SPA）88

一、SPA的性质88

二、SPA各种免疫检测试剂的制备89

三、SPA的应用90

第四节　IHC的标准化和自动化92

第五节 IHC增敏方法的研究进展及技术改进93

一、免疫荧光组织化学技术93

二、免疫酶组织化学技术94

三、多聚螯合物酶法94

四、胶体金属－抗体复合物方法95

五、催化信号放大系统95

六、滚动式循环放大法96

七、原位免疫PCR97

八、提高IHC方法敏感性的辅助手段98

参考文献99

第六章 免疫金银组织化学技术101

第一节　溶胶的基本概念101

一、胶体金101

二、胶体金的一般性状101

第二节　胶体金的制备102

一、制备前的准备103

二、胶体金分散颗粒的制备103

三、胶体金的质量鉴定106

第三节　胶体金探针的制备106

一、原理106

二、待标记蛋白质的准备106

三、胶体金pH值的调整106

四、确定胶体金与待标记蛋白质用量107

六、胶体金标记蛋白质的纯化108

五、蛋白质的胶体金标记108

七、胶体金探针的质量鉴定109

第四节 光镜免疫金组织化学染色方法110

一、原理110

二、IGS间接法染色步骤110

第五节　光镜免疫金银组织化学110

一、原理110

二、IGSS操作流程111

三、双PAG法112

第六节　彩色免疫金银染色方法113

一、操作步骤113

二、CIGSS的优点114

第七节　物理显影液的配制和IGSS的评估114

一、物理显影液的配制114

二、IGSS法的评价及其注意事项115

参考文献117

第七章 双重或多重免疫组织化学标记118

第一节　概述118

第二节　消除双重染色间交叉反应的方法118

一、分步固定法119

二、解离洗脱法119

三、位点封闭法119

第三节　光镜下的双重及多重免疫标记染色119

一、双重或多重免疫荧光标记染色119

二、双重或多重免疫酶标记染色122

三、其他双重标记法染色124

第四节 电镜下的双重及多重免疫标记125

一、标记方法125

二、操作125

第五节 双重或多重标记的注意事项126

参考文献127

第八章 免疫组织化学结果的分析和判断128

第一节　免疫组织化学结果的判断原则128

第二节　对照染色设计129

一、阳性对照129

二、阴性对照129

三、自身对照130

第三节　非特异染色130

一、非特异染色的原因130

二、消除非特异染色的方法132

第四节　染色失败的原因及其处置方法134

一、对照切片和待检组织切片均不着色134

二、阴性对照切片没有染色，而阳性对照标本和待检测组织切片呈弱阳性135

三、切片染色太深或整张切片均出现染色136

四、切片上有许多杂质136

六、复染色太深或复染和DAB呈色反差太小137

七、待测组织标本未按所期望的表达（胞质及核）137

五、没有复染色或复染色过浅137

八、所有切片包括阴性对照切片均呈现弱阳性反应138

九、所有切片均出现非特异性背景染色138

十、阳性对照切片显色良好，而待检测切片均无阳性反应，呈现假阴性139

十一、待检测切片着色不匀139

参考文献140

第九章 原位杂交探针的种类和标记方法141

第一节　探针的类型和制备141

一、DNA探针141

二、RNA探针141

三、寡核苷酸探针142

第二节　探针标记的基本原理142

一、标记物142

二、标记方法143

第三节　探针标记的技术146

三、标记探针的纯化146

四、标记结果的检验146

一、核素标记147

二、生物素标记147

三、地高辛标记147

四、荧光素标记147

五、联合标记147

六、常用的探针标记技术148

参考文献154

第十章 原位核酸分子杂交技术155

第一节 原位核酸分子杂交技术的原理155

第二节 原位分子杂交技术的基本方法156

一、固定156

二、玻片和组织切片的处理157

六、对照实验和结果的判断158

五、显示158

四、杂交后处理158

三、杂交158

第三节　原位DNA分子杂交方法159

一、地高辛（Dig）标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法159

二、生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA的方法160

第四节　RNA原位核酸杂交方法162

一、基本原理162

二、RNA原位杂交163

三、cRNA探针检测组织切片中RNA的原位杂交165

四、冰冻切片的地高辛标记RNA探针的原位杂交操作程序167

五、用寡核苷酸探针检测组织切片中RNA的原位杂交168

六、用cDNA探针检测体外培养细胞中RNA的原位杂交171

第五节　荧光原位杂交（FISH）技术172

一、FISH的概念173

二、杂交类型和方法173

三、杂交失败或杂交信号弱的原因174

四、可用于FISH检测的探针175

第六节　原位PCR检测技术176

一、原位PCR技术特点176

二、直接法原位PCR扩增176

三、间接法原位PCR扩增176

四、应注意的问题177

五、对照实验177

第七节 电镜原位核酸分子杂交技术177

一、概述177

二、电镜原位杂交的种类178

三、电镜原位杂交的注意事项179

四、电镜原位杂交（包埋前、后）操作流程179

参考文献180

第十一章 组织芯片的制备和应用182

第一节　组织芯片的研究进展182

一、TMA的研究进展182

一、石蜡块组织芯片的制备183

第二节　组织芯片的制备183

二、TMA的分类183

二、冰冻组织的组织芯片制备184

三、细胞芯片的制备185

第三节　组织微阵列的应用185

一、在肿瘤研究中的应用185

二、其他方面的应用189

第四节　TMA的优点和存在的问题190

一、TMA的优点190

二、TMA存在的问题190

三、应用前景和有待解决的问题191

参考文献191

第十二章　细胞凋亡的检测技术194

第一节 细胞凋亡的基本概念和特征194

一、基本概念194

二、基本特征194

第二节 细胞凋亡的形态学检测方法197

一、HE染色198

二、甲基绿－派若宁染色法198

三、吖啶橙染色法198

四、Hoeehst 33258染色法199

五、磷脂酰丝氨酸外翻检测方法199

六、透射电镜观察方法200

七、其他的检测方法201

第三节　细胞凋亡的凝胶电泳检测法201

一、常规方法201

二、快速法202

三、连接介导PCR ladder检测202

第四节　流式细胞仪检测方法203

一、激光散射光分析203

二、细胞膜完整性及膜转运功能的测定203

第五节　细胞器功能的检测205

第六节　原位末端标记方法206

一、线粒体跨膜电位的测定206

二、溶酶体功能的检测206

一、DNA缺口平移法207

二、TUNEL检测方法207

三、TUNEL检测时的注意事项210

第七节　激光扫描细胞形态分析方法211

第八节　存在的问题与发展方向211

一、如何选择细胞凋亡的研究方法211

二、细胞凋亡和细胞坏死的界定212

三、其他的检测方法213

参考文献213

第十三章　Ig和TCR基因重排检测原理与方法215

第一节　概述215

第二节　基因重排的PCR检测215

一、模板DNA制备216

三、DNA质量的检测217

二、DNA浓度和纯度的测定217

四、DNA的PCR扩增218

五、PCR产物的电泳和银染220

六、PCR扩增产物的分析222

第三节 克隆性基因重排与临床诊断223

一、克隆性基因重排为提示恶性的重要指标223

二、克隆性基因重排的敏感性和覆盖面223

三、克隆性基因重排对区分淋巴瘤T细胞、B细胞来源的作用223

四、克隆演化223

五、克隆性基因重排和MRD检测223

六、克隆性基因重排与交界性淋巴组织增生性疾病224

七、克隆性基因重排与易发生淋巴瘤的疾病224

参考文献224

第二节　免疫电镜技术225

三、电镜的反差与成像225

二、分辨率和放大倍数225

一、工作原理225

第十四章 电镜细胞化学技术225

第一节 电子显微镜的基本知识225

一、免疫电镜技术的基本方法226

二、透射免疫电镜技术基本操作步骤227

三、包埋前胶体金标记免疫电镜技术操作流程228

四、包埋后免疫电镜技术操作流程229

五、双重或多重免疫电镜标记法231

六、铁蛋白标记免疫电镜技术234

七、扫描免疫电镜技术235

八、冷冻蚀刻免疫电镜技术236

二、电镜酶细胞化学样品制备流程237

三、常用酶细胞化学孵育液配方及反应条件237

一、电镜酶细胞化学基本原理237

第三节　电镜酶细胞化学技术237

四、酶细胞化学必须注意的问题239

第四节 电子显微镜的其他常用细胞化学技术239

一、离子细胞化学技术240

二、阴离子位点显示技术241

三、自由基显示技术242

四、示踪细胞化学243

五、凝集素显示糖类细胞化学243

六、乙酰胆碱受体显示细胞化学243

七、细胞膜糖类电镜显示法244

第五节 电镜负染色和免疫放射自显影技术244

一、电镜负染色技术244

二、电镜免疫放射自显影术246

参考文献249

一、胶原纤维染色251

二、网状纤维与胶原纤维染色251

第十五章　常用特殊染色技术251

第一节　结缔组织染色技术251

三、弹力纤维与胶原纤维染色252

四、结缔组织三色染色法253

五、胶原蛋白、弹力蛋白和黏蛋白染色253

第二节　肌肉组织染色技术254

一、横纹肌组织染色254

二、早期心肌组织病变染色255

第三节　神经组织染色技术255

一、神经尼氏体染色255

二、神经纤维染色256

三、神经髓鞘染色256

第四节　脂质染色技术257

一、油红O染色257

第五节　糖类染色技术258

一、糖原染色258

二、苏丹Ⅲ染色258

二、黏液物质染色259

三、羊水角化鳞状上皮的角蛋白染色259

第六节　色素类染色技术260

一、含铁血黄素染色260

二、胆色素染色261

三、黑色素染色261

一、纤维素染色262

第七节　病理的内源性沉着物染色技术262

四、脂褐素染色262

二、淀粉样物质染色263

第八节　病原微生物染色技术263

一、真菌染色264

二、细菌染色264

三、抗酸杆菌染色265

四、乙型肝炎表面抗原染色265

一、肥大细胞染色266

第九节　肥大细胞和钙质染色技术266

二、钙质染色267

第十节　核酸染色技术268

一、DNA染色268

二、核仁组成区嗜银蛋白染色268

参考文献269

第十六章 免疫组织化学常用抗体标记谱系270

第一节　上皮细胞标志270

一、广谱上皮标志270

二、选择性上皮标志272

第二节　间叶细胞标志275

一、广谱间叶标志275

二、肌源性标志275

三、血管内皮标志276

六、其他间叶标志277

五、间皮细胞标志277

四、纤维组织细胞标志277

第三节　神经组织标志278

一、广谱神经标志278

二、选择性神经标志279

第四节　神经内分泌细胞标志280

一、垂体激素280

二、胰岛激素280

三、甲状腺激素281

四、其他激素281

第五节　淋巴造血细胞标志281

一、广谱淋巴细胞标志281

二、B淋巴细胞标志282

三、NK/T淋巴细胞标志284

四、霍奇金细胞相关标志285

五、其他标志286

第六节　肿瘤相关抗原288

第七节　细胞增殖标志289

第八节　细胞凋亡抗体290

第九节　癌基因和抑癌基因相关抗体291

第十节　肿瘤细胞耐药标志293

第十一节　性激素受体标志294

第十二节　细胞黏附分子抗体295

第十三节　病原微生物抗体296

参考文献296

第十七章 免疫组织化学在病理诊断及研究中的应用297

第一节　肿瘤分类中的应用297

一、上皮细胞及其肿瘤298

二、间叶细胞及其肿瘤299

三、神经源性肿瘤300

五、淋巴造血组织肿瘤302

四、神经内分泌肿瘤302

第二节 肿瘤免疫组织化学鉴别诊断305

一、小圆细胞肿瘤305

二、梭形细胞肿瘤306

三、上皮样肿瘤307

四、多形性肿瘤308

五、腺泡状肿瘤308

六、黏液样肿瘤309

七、转移性肿瘤309

第三节　肿瘤细胞耐药性中的应用310

一、P-糖蛋白310

二、多耐药相关蛋白310

三、肺耐药相关蛋白311

四、拓扑异构酶311

五、谷胱甘肽S转移酶311

一、概述312

第四节　肿瘤性激素受体中的应用312

六、金属硫蛋白312

七、药物代谢酶类——胸苷酸合成酶312

二、雌激素受体313

三、孕激素受体313

四、雌激素调节蛋白313

五、雄激素受体313

第五节　肿瘤细胞增殖活性中的应用313

一、生长分数313

二、增殖活性与预后313

三、增殖活性与治疗314

第六节　肿瘤细胞凋亡中的应用315

第七节　肿瘤相关基因中的应用316

一、癌基因316

二、肿瘤抑制基因318

二、EB病毒（EBV）319

三、乙型肝炎病毒（HBV）319

一、人乳头状瘤病毒（HPV）319

第八节　病原微生物检测319

四、幽门螺杆菌（HP）320

参考文献320

第十八章 肿瘤免疫组化标记的形态学特征及其意义321

第一节 阳性标记的显色特征321

一、阳性标记的色度特征321

二、阳性标记的强度特征322

三、阳性细胞的量化标准323

第二节　抗原在细胞中的定位323

一、胞膜型表达324

二、胞核型表达326

三、胞质型表达329

四、胞膜－质型表达331

五、胞核－质型表达332

一、局灶型333

第三节　阳性标记的组织学特征333

三、片块型334

四、网状型334

二、弥漫型334

五、腺管型335

六、腔缘型335

七、其他类型336

第四节　阴性结果及其意义336

一、完全阴性337

二、部分阴性337

第五节　影响抗原定位的主要因素337

一、组织结构不清晰337

第六节　肿瘤抗原异常表达338

一、肿瘤细胞不同分化阶段异常表达338

三、非特异染色的干扰338

二、组织细胞特殊结构338

二、肿瘤细胞抗原异位表达339

三、肿瘤细胞异常分化340

四、抗体交叉反应341

五、肿瘤细胞吸附和吞噬341

参考文献342

一、IHC常用方法操作流程343

附录Ⅰ 免疫组织化学和原位杂交常用操作流程343

附录343

二、原位杂交操作流程347

附录Ⅱ 免疫组织化学常用缓冲液350

附录Ⅲ 原位杂交组织化学常用试剂及配制353

附录Ⅳ　各种市售常用酸碱的浓度355

附录Ⅴ 玻璃及塑料器皿的硅烷化355

附录Ⅵ 蛋白质含量的测定方法356

附录Ⅶ　X-gal染色方法357