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第一篇 通过感染模型研究细菌的毒力3

第一章 用大蜡螟作为感染模型进行筛选3

1 前言4

2 材料5

2.1 细菌菌株和昆虫5

2.2 注射装置和设备5

2.3 细菌生长和溶液的配制5

3 研究方法6

3.1 细菌准备6

3.2 大蜡螟的准备和感染6

注释7

参考文献8

第二章 肠道感染的动物模型——果蝇9

1 前言10

2 材料13

2.1 果蝇的培养13

2.2 果蝇的品系和处理13

2.3 细菌培养14

2.4 经口感染和生存分析14

2.5 血淋巴中的细菌计数15

2.6 吞噬作用的阻滞15

2.7 肠道解剖15

2.8 肠道固定15

2.9 肠道免疫染色16

2.10 将解剖后的肠道置于显微镜载玻片上，并进行成像和数据分析16

2.11 SYTOX Green分析16

2.12 Smurf试验17

2.13 RNA提取17

2.14 蛋白质提取17

2.15 BONCAT方法监测整体的蛋白翻译18

2.16 监测copper细胞区域的酸化18

3 方法18

3.1 经口感染18

3.2 生存分析19

3.3 果蝇体内全部的菌量19

3.4 血淋巴中的细菌计数19

3.5 肠上皮内的细菌数20

3.6 吞噬作用的阻滞20

3.7 肠道解剖20

3.8 肠道的封闭和免疫染色21

3.9 肠道组织涂片21

3.10 SYTOX Green方法检测上皮的完整性22

3.11 Smurf试验检测消化道的完整性22

3.12 从成年果蝇的中肠提取RNA22

3.13 从解剖的肠道中提取蛋白质23

3.14 通过BONCAT方法监测蛋白质的合成23

3.15 监测果蝇中肠泌酸区域的生理功能23

注释24

致谢28

参考文献28

第三章 斑马鱼胚胎作为动物模型研究细菌毒力32

1 前言33

1.1 显微注射34

2 材料34

2.1 取卵并准备注射34

2.2 细菌培养和培养液的准备35

2.3 显微注射35

2.4 细菌增殖的分析35

2.5 生存分析和活体成像的工具36

2.6 qRT-PCR和RNA-Seq分析36

3 方法36

3.1 获取鱼卵并准备感染实验的胚胎36

3.2 培养洋葱伯克氏菌用于感染及接种液的准备37

3.3 显微注射37

3.4 胚胎生存研究38

3.5 测定细菌增殖解读细菌的毒力38

3.6 在感染期的实时观测39

3.7 提取RNA用于qRT-PCR和RNA序列的分析39

3.8 qRT-PCR的分析39

注释40

致谢47

参考文献47

第四章 研究小鼠活体内宿主和病原的相互作用并通过实时生物光子成像进行可视化观察50

1 前言51

1.1 生物荧光标记病原菌的可视化51

1.2 用急性毒性布鲁氏菌感染小鼠模型51

1.3 慢性毒力布鲁氏菌感染小鼠模型52

1.4 用突变型布鲁氏菌感染小鼠模型52

1.5 评价候选的疫苗53

1.6 宿主糖、赤藓糖醇及布鲁氏菌感染的作用53

2 材料54

2.1 羊布鲁氏菌54

2.2 抗生素54

2.3 质粒和转座子的准备54

2.4 用于老鼠安乐死的设备55

2.5 用于羊布鲁氏菌电穿孔的设备和培养基55

2.6 老鼠模型和感染55

2.7 CCD成像55

2.8 赤藓糖醇运输实验56

3 方法56

3.1 构建发生物荧光的布鲁氏菌56

3.2 感染老鼠57

3.3 生物发光成像技术监测老鼠的感染状况57

3.4 组织的离体成像57

3.5 赤藓糖醇运输实验57

注释58

致谢60

参考文献60

第五章 基于活体双光子成像技术的哺乳动物细菌感染研究63

1 前言64

2 材料66

2.1 细菌及培养条件66

2.2 荧光团——共轭右旋糖酐66

2.3 通过显微注射诱导感染66

3 方法67

3.1 术前准备及细菌的培养67

3.2 实验动物的术前准备68

3.3 大鼠的外科手术以及细菌浸液（输液）68

3.4 成像过程69

3.5 后成像过程70

注释70

致谢72

参考文献72

第二篇 宿主与细菌在细胞层面的相互作用77

第六章 Cre报告基因分析易位（CRAfT）：一种用于研究宿主细胞内蛋白转运的工具77

1 前言78

2 材料79

2.1 细菌菌株、Cre质粒构建、转基因报告宿主79

2.2 农杆菌属培养基储液79

2.3 农杆菌的生长80

2.4 平板培养基的储备液80

2.5 植物培养和根基的转换81

2.6 用于酵母培养基的储备溶液82

2.7 酵母生长和转换82

3 方法83

3.1 植物测定83

3.2 酵母测评84

注释85

参考文献89

第七章 宿主与细菌蛋白间相互关系的检测：真核核仁蛋白与弗朗西斯菌属延长因子Tu的相互作用92

1 前言93

2 材料93

2.1 用土拉热杆菌感染人体细胞93

2.2 LVS亚细胞分离的准备94

2.3 免疫印迹法94

2.4 荧光实验95

2.5 抗体和多肽95

2.6 琼脂糖珠95

3 方法96

3.1 核仁蛋白肽可降低LVS与人类细胞的相互作用96

3.2 核仁蛋白肽可降低LVS对人类细胞的感染96

3.3 Anti-EF-Tu抗体降低LVS与人类细胞上的相互作用97

3.4 Anti-EF-Tu可以降低LVS对人类细胞的感染97

3.5 用生物素一亲和素珠进行pull down试验98

3.6 用GST琼脂糖珠进行Pull-down试验99

3.7 共聚焦显微镜99

注释100

参考文献101

第八章 劫持宿主蛋白酶体以时序性降解细菌效应蛋白104

1 前言105

1.1 背景105

1.2 方法概述106

2 材料107

2.1 体外泛素连接酶试验107

2.2 分离被军团杆菌感染的细胞并用于检测泛素化效应蛋白108

2.3 在军团菌感染细胞中检测泛素化蛋白的降解。108

3 方法109

3.1 泛素连接酶的体内测定109

3.2 分离被军团杆菌感染的细胞以检测泛素化的效应蛋白109

3.3 军团菌感染细胞内的泛素化蛋白降解检测110

注释111

致谢112

参考文献112

第九章 军团杆菌感染期磷酸肌醇动力学活细胞成像114

1 前言115

1.1 嗜肺军团杆菌破坏磷脂酰肌醇脂质115

1.2 阿米巴盘基网柄菌做为一种军团杆菌的感染模型116

1.3 LCV PI模型的活细胞成像分析116

2 材料117

2.1 嗜肺军团菌117

2.2 盘基网柄菌118

2.3 显微镜检查118

3 方法119

3.1 用于感染的嗜肺军团菌的培养119

3.2 盘基网柄菌培养119

3.3 转化盘基网柄菌用来表达荧光探针119

3.4 接种盘基网柄菌用于感染和显微观察120

3.5 快速感染过程中的实时成像120

3.6 动态感染过程中的实时观察121

注释121

致谢123

参考文献123

第十章 细菌蛋白干扰细胞凋亡的研究126

1 前言127

2 材料127

2.1 培养物127

2.2 培养基和材料128

2.3 免疫标记129

2.4 质粒129

2.5 其他试剂及设备129

3 方法131

3.1 被感染细胞的免疫标记131

3.2 转染132

3.3 诱导细胞凋亡132

3.4 诱导凋亡细胞的免疫染色133

3.5 PARP裂解分析133

3.6 转化酵母细胞中Ats-1的定位134

3.7 Ats-1使酵母细胞避免由Bax诱导引起的生长停滞135

3.8 Bax转化至酵母线粒体的过程分析135

注释137

参考文献138

第十一章 基于双分子荧光互补技术研究植物宿主内的微生物病原体蛋白质互作成像140

1 前言141

2 材料142

3 方法147

3.1 使用pSAT－衍生的植物BiFC载体进行克隆147

3.2 制备烟草BY-2原生质体148

3.3 PEG介导BY-2原生质体的转染148

3.4 获得荧光图像149

3.5 先进的BiFC技术和问题排除149

注释149

致谢154

参考文献154

第十二章 细菌感染小鼠树突状细胞的TLR信号应答研究157

1 前言158

2 材料159

2.1 准备BMDCs159

2.2 BMDCs感染160

2.3 树突状细胞的活化和TLR应答分析160

3 方法162

3.1 BMDCs准备162

3.2 细菌感染骨髓树突状细胞163

3.3 树突状细胞活化和Toll样受体免疫应答分析163

注释165

参考文献168

第三篇 组学与大规模筛查173

第十三章 利用果蝇细胞siRNA筛选鉴定宿主感染所需的因素173

1 前言174

2 材料175

2.1 菌株和细胞175

2.2 培养基和抗生素175

2.3 抗体／染料／试剂176

2.4 显微镜176

2.5 药物176

2.6 溶液和试剂177

2.7 设备177

3 方法177

3.1 细菌培养177

3.2 细胞培养177

3.3 布鲁氏菌感染，药物治疗及庆大霉素保护实验178

3.4 感染宿主S2细胞的活力分析178

3.5 对亚细胞标记的感染果蝇S2细胞进行表达分析179

3.6 免疫荧光显微镜分析179

3.7 药物治疗179

3.8 dsRNAs的生成180

3.9 RNAi介导的基因敲除与分析180

3.10 小鼠胚胎成纤维细胞感染181

3.11 统计分析181

注释181

参考文献184

第十四章 胞内细菌的纯化：从宿主细胞中分离有活性的流产布鲁氏菌186

1 前言187

2 材料187

2.1 细胞培养和感染188

2.2 胞内细菌的纯化188

2.3 细菌的免疫检测189

2.4 免疫印迹分析190

2.5 RNA转录的检测190

3 方法191

3.1 细胞培养和细菌接种准备191

3.2 感染191

3.3 胞内细菌的提取和纯化192

3.4 纯化细菌的免疫检测192

3.5 纯化细菌的免疫印迹分析193

3.6 检测纯化细菌的RNA转录193

注释194

致谢196

参考文献196

第十五章 对斑马鱼感染模型流式细胞分选（FACS-Sorted）免疫细胞群RNA测序以识别细胞对细胞内病原体的特异性反应198

1 前言199

2 材料200

2.1 细胞分离和FACS分选组成200

2.2 RNA提取和文库制备200

3 方法201

3.1 细胞分离和FACS分选201

3.2 RNA提取，文库制备和RNA测序201

3.3 数据分析和质量评估202

注释203

致谢205

参考文献205

第十六章 细菌高通量鸟枪蛋白质组学分析的捷径209

1 前言210

2 材料210

2.1 获得细菌培养物210

2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）211

2.3 蛋白质的还原，烷基化和消化211

2.4 nanoLC-MS/MS212

2.5 鉴定212

2.6 定量212

3 方法212

3.1 获得细菌培养物212

3.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）212

3.3 蛋白质还原，烷基化和消化213

3.4 nanoLC-MS/MS213

3.5 鉴定214

3.6 定量214

注释214

致谢216

参考文献216

第十七章 PATRIC生物信息学资源中心的比较基因组分析218

1 前言219

2 材料220

3 方法221

3.1 搜索目的基因221

3.2 搜索目的基因组并进行组别归纳以进行比较分析222

3.3 比较基因组学：利用蛋白质家族分类检查Pan蛋白质组224

3.4 比较代谢组学：检查多个基因组的代谢途径227

致谢229

参考文献229

第四篇 难治性细菌的研究方法233

第十八章 洋葱伯克霍尔德菌及其他多重耐药革兰氏阴性菌的基因无标记敲除方法233

1 前言234

2 材料235

2.1 生长培养基、抗生素、化学试剂235

2.2 细菌菌株235

2.3 核酸序列236

2.4 DNA载体236

2.5 引物236

2.6 分子克隆所涉及的酶，试剂盒和材料237

3 方法238

3.1 缺失质粒的构建（pDeIatsR）238

3.2 缺失质粒结合导入伯克霍尔德菌239

3.4 互补质粒结合导入伯克霍尔德菌241

注释241

致谢243

参考文献243

第十九章 在贝氏柯克斯体中的基因失活246

1 前言247

2 材料248

2.1 自杀质粒的构建248

2.2 贝氏柯克斯体的转化与缺失突变体的筛选248

2.3 贝氏柯克斯体基因敲除分析249

3 方法249

3.1 特异性基因自杀质粒的构建249

3.2 贝氏柯克斯体的转化251

3.3 通过PCR鉴定初级整合子251

3.4 基因缺失菌株的蔗糖筛选252

3.5 通过PCR鉴定基因缺失252

3.6 缺失突变体的克隆252

3.7 GOI缺失的验证253

注释253

致谢255

参考文献255

第二十章 鉴定细胞内病原沙眼衣原体毒力因子的一种化学诱变方法257

1 前言258

2 材料258

2.1 细菌和细胞培养258

2.2 化学诱变259

2.3 菌斑纯化259

2.4 全基因组测序259

2.5 设备260

3 方法260

3.1 化学诱变260

3.2 通过菌斑克隆纯化分离衣原体突变株260

3.3 全基因组测序筛选衣原体突变株261

3.4 产生衣原体重组子262

注释263

参考文献264

附图267