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第1章 绪论1

1.1 蛋白质的研究历史1

1.2 蛋白质的理化性质和生物学特性1

1.3 蛋白质纯化手段的历史回顾2

1.4 纯化蛋白的应用2

参考文献3

第1部分 材料的预处理和蛋白质的粗提6

第2章 不同来源材料的预处理6

2.1 不同材料的预处理6

2.1.1 植物材料的预处理7

2.1.2 动物材料的预处理7

2.1.3 微生物材料的预处理8

2.2 细胞的破碎8

2.2.1 机械法9

2.2.2 非机械法11

方案2.1 超声波法提取烟草叶中的3-磷酸甘油脱氢酶12

方案2.2 从猪胰脏中提取胰凝乳蛋白酶13

方案2.3 从大肠杆菌中提取诱导表达的（His）6-X14

参考文献16

第3章 蛋白质的沉淀17

3.1 盐析法17

3.2 有机溶剂沉淀法18

3.3 等电点沉淀法19

3.4 非离子多聚物沉淀法19

3.5 选择性沉淀法20

方案3.1 用盐析法选择性沉淀蛋白质21

方案3.2 用有机溶剂沉淀蛋白质22

方案3.3 使用蛋白质排阻和拥挤剂选择性沉淀蛋白质23

参考文献24

第4章 蛋白质的浓缩26

4.1 吸附法26

4.2 超滤法27

4.3 沉淀法28

4.4 透析法28

4.5 冷冻干燥法28

4.6 双水相分离法29

方案4.1 用透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液29

方案4.2 用不对称圆盘膜超滤进行浓缩或透析31

参考文献32

第2部分 色谱法分离纯化蛋白质35

参考文献35

第5章 凝胶过滤色谱36

5.1 基本原理36

5.2 实验方案设计37

5.2.1 凝胶介质的选择37

5.2.2 凝胶介质的预处理37

5.2.3 色谱柱的选择38

5.2.4 凝胶柱的装填38

5.2.5 样品处理和上样38

5.2.6 洗脱和收集39

5.2.7 色谱柱的清洗、再生与保存39

方案5.1 用凝胶过滤色谱更换缓冲液39

方案5.2 凝胶过滤色谱分离三种分子量不同的蛋白质41

参考文献43

第6章 离子交换色谱44

6.1 基本原理44

6.2 实验方案设计46

6.2.1 离子交换介质的选择46

6.2.2 流动相的选择47

6.2.3 色谱柱的选择47

6.2.4 离子交换剂预处理和装柱47

6.2.5 加样48

6.2.6 洗脱48

6.2.7 洗脱组分的收集和分析49

6.2.8 离子交换剂的再生、清洗与储存49

方案6.1 弱阴离子交换色谱和强阳离子交换色谱在分离纯化单克隆抗体中的应用49

参考文献53

第7章 亲和色谱54

7.1 基本原理54

7.2 亲和色谱的几种类型55

7.2.1 金属螯合亲和色谱55

7.2.2 免疫亲和色谱56

7.2.3 凝集素亲和色谱56

7.3 实验方案设计56

7.3.1 亲和吸附剂的选择56

7.3.2 装柱56

7.3.3 上样57

7.3.4 吸附57

7.3.5 流速和清洗57

7.3.6 洗脱57

7.3.7 再生和保存58

方案7.1 亲和色谱纯化抗体融合蛋白58

方案7.2 金属螯合亲和色谱分离大肠杆菌重组表达的蛋白61

方案7.3 从大肠杆菌中提取诱导表达的GST标签融合蛋白63

参考文献65

第8章 疏水色谱66

8.1 基本原理66

8.2 实验方案设计67

8.2.1 疏水配基的选择67

8.2.2 离子强度及种类67

8.2.3 破坏水化作用的物质68

8.2.4 温度68

8.2.5 洗脱方式68

8.2.6 表面活性剂68

8.2.7 色谱柱使用后的处理69

方案8.1 用疏水色谱去除抗体融合蛋白样品中的多聚体69

参考文献72

第9章 分子印迹技术73

9.1 分子印迹主要术语74

9.1.1 功能单体74

9.1.2 交联剂74

9.1.3 溶剂和致孔剂75

9.1.4 引发剂75

9.1.5 适用的印迹分子76

9.2 分子印迹的分类76

9.2.1 共价型76

9.2.2 非共价型77

9.3 印迹效率的评价77

9.3.1 保留因子77

9.3.2 分离因子77

9.3.3 分离度77

9.3.4 等温吸附方程78

9.3.5 经典孔径分布曲线78

9.3.6 吸附曲线78

9.3.7 其他手段78

9.4 分子印迹技术在蛋白质分离中的展望78

方案9.1 溶菌酶分子印迹的制备和应用80

方案9.2 血红蛋白分子印迹的制备和应用83

参考文献86

第10章 高效液相色谱法分离纯化蛋白质88

10.1 高效液相色谱的基本原理和分类88

10.1.1 与经典液相（柱）色谱法比较88

10.1.2 高效液相色谱法的特点88

10.1.3 高效液相色谱仪89

10.1.4 高效液相色谱常用参数90

10.1.5 高效液相色谱仪标准操作规程92

10.2 常用流动相的极性和选择94

10.2.1 何谓流动相94

10.2.2 流动相的性质要求94

10.2.3 流动相的选择95

10.2.4 准备流动相的一般过程95

10.2.5 卤代有机溶剂应特别注意的问题97

10.2.6 HPLC用水97

10.2.7 常用流动相组分的物理特性97

10.3 常用检测器97

10.3.1 概述97

10.3.2 检测器的性能指标98

10.3.3 各类检测器99

10.4 特异性蛋白专用柱特点和操作106

10.4.1 固定相106

10.4.2 色谱类型106

10.4.3 常用键合相的表面化学结构107

10.4.4 色谱柱107

10.5 常见故障排除109

10.5.1 与色谱柱相关的问题109

10.5.2 造成色谱峰（不对称）拖尾的原因110

10.5.3 如何解决峰形拖尾的问题110

10.5.4 如何贮存色谱柱111

10.5.5 谱图问题111

10.5.6 常见故障111

10.6 高效液相色谱在蛋白质分离纯化中的应用实例115

10.6.1 反相色谱分离蛋白质115

方案10.1 肽类酶解混合物色谱过程117

方案10.2 蛋白质样品纯化色谱过程118

方案10.3 白细胞介素-2反相高效液相色谱纯化119

方案10.4 水蛭素12肽的反相高效液相色谱纯化120

10.6.2 疏水作用色谱121

方案10.5 高效疏水作用色谱分离纯化四种蛋白质纯品125

方案10.6 人唾液蛋白的高效疏水色谱分离纯化126

方案10.7 疏水作用色谱法同时纯化及复性基因重组人干扰素127

10.6.3 高效离子交换液相色谱法纯化蛋白质分子128

方案10.8 高效阴离子交换液相色谱法129

方案10.9 高效阳离子交换液相色谱法130

方案10.10 高效离子交换色谱法分离皖南尖吻蝮蛇毒活性组分131

方案10.11 高效离子交换色谱（HPIEC）分离经HPHIC分离后的微粒体P450132

10.6.4 高效排阻液相色谱法纯化蛋白质分子133

方案10.12 高效体积排阻液相色谱基本操作程序135

方案10.13 重组人粒细胞集落刺激因子分子量测定136

参考文献137

第11章 毛细管电色谱及其在蛋白质分离纯化中的应用138

11.1 毛细管电色谱138

11.2 毛细管电色谱技术历史回顾138

11.3 毛细管电色谱基本分离模式139

11.3.1 开管柱电色谱139

11.3.2 填充柱电色谱140

11.3.3 整体柱电色谱140

11.3.4 CEC分离模式的选择141

11.3.5 CEC、CE和HPLC的对照分析141

11.4 毛细管电色谱在蛋白分离分析中的新技术142

11.4.1 在线样品预浓集-毛细管电色谱联用技术142

11.4.2 毛细管电色谱-质谱联用技术在蛋白分离分析中的应用143

11.5 毛细管电色谱基本术语和原理143

11.5.1 电迁移和电渗、电渗流、电动现象、焦耳热效应143

11.5.2 保留机制和分离机理143

11.6 毛细管电色谱仪器144

11.6.1 毛细管电色谱仪器的基本要求144

11.6.2 基本装置145

11.6.3 检测系统145

方案11.1 离子交换电色谱纯化蛋白质的研究146

方案11.2 微流控芯片-多维毛细管电色谱分离牛血清白蛋白酶消解产物150

方案11.3 毛细管电色谱耦合飞行时间质谱分离鉴定卵清蛋白的酶解产物153

参考文献154

第12章 其他色谱分析方法简介156

12.1 超临界流体色谱156

12.1.1 超临界流体简介156

12.1.2 超临界流体色谱简介156

12.1.3 SFC的流动相156

12.1.4 SFC的固定相157

12.1.5 SFC的检测系统157

12.1.6 联机分析与定性158

12.2 逆流色谱158

12.2.1 简介158

12.2.2 逆流色谱的特点159

12.2.3 溶剂体系的选择和制备159

12.2.4 CPC的检测仪器160

12.3 亲水色谱160

12.3.1 简介160

12.3.2 HILIC的特点160

12.3.3 HILIC固定相161

12.3.4 展望162

12.4 快速色谱162

12.4.1 简介162

12.4.2 快速色谱原理与系统组成162

12.4.3 与制备HPLC的关系163

参考文献163

第3部分 电泳法分离纯化蛋白质166

第13章 聚丙烯酰胺凝胶电泳166

13.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳常用溶液及配制166

13.2 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳167

13.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳167

13.4 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳169

13.5 小分子多肽凝胶电泳170

13.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳170

13.7 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白的回收170

方案13.1 SDS变性电泳分析牛血清白蛋白（BSA）171

方案13.2 BSA变性梯度胶电泳方案173

方案13.3 小分子多肽（抗菌肽）凝胶电泳174

方案13.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳175

参考文献177

第14章 聚丙烯酰胺等电聚焦178

14.1 聚丙烯酰胺等电聚焦具有高分辨率的特点178

14.2 等电聚焦pH梯度的形成178

14.3 等电聚焦电泳板式179

方案14.1 HeLa细胞裂解液等电聚焦179

参考文献181

第15章 双向电泳182

15.1 样品的制备182

15.2 IPG的选择和上样183

15.3 第一向电泳：等电聚焦电泳（IEF）183

15.4 IPG胶条平衡184

15.5 采用垂直系统进行第二向电泳：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）184

方案15.1 HeLa细胞周期依赖性蛋白表达和修饰的分析184

参考文献186

第4部分 蛋白质纯化效果的评价和蛋白质分析188

第16章 蛋白质浓度、纯度及活性的分析188

16.1 测定蛋白质浓度的方法简介188

16.1.1 凯氏定氮法188

16.1.2 双缩脲法188

16.1.3 Lowry法189

16.1.4 紫外分光光度法189

16.1.5 考马斯亮蓝染色法190

16.1.6 BCA检测法190

16.2 测定蛋白质纯度的方法简介190

16.2.1 电泳法190

16.2.2 色谱法190

16.2.3 免疫化学法190

16.3 测定蛋白质活性的方法简介191

方案16.1 双缩脲法测定未知蛋白的含量191

方案16.2 BCA法测定蛋白质浓度192

方案16.3 豆类中球蛋白的定量分析193

方案16.4 心肌、骨骼肌线粒体内膜ATPase的测定194

方案16.5 荧光分光光度法测定肌肉中乳酸脱氢酶的活性195

参考文献196

第17章 蛋白质的分析及应用197

17.1 质谱技术在蛋白质分析中的应用197

17.2 核磁共振法在蛋白质分析中的应用197

17.3 X射线晶体学相关的蛋白质纯化198

方案17.1 白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶分离提纯及分子量的质谱测定198

方案17.2 肿瘤差异蛋白质的质谱定性198

方案17.3 果蝇蛋白质磷酸化的质谱分析200

方案17.4 核磁共振法研究细胞色素空间结构202

方案17.5 以X射线衍射为目的的SARS-COV Mprc蛋白的分离纯化202

参考文献203