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第一章 大肠杆菌表达体系1

第一节 原核表达载体2

一、pET载体4

二、pKK223-3载体5

三、IMPACTTM系统载体和pMALTM系统载体5

四、pWIN表达系统5

五、pGEX系统5

第二节 原核表达宿主菌6

第三节 选择构建载体的策略8

第四节 重组蛋白的溶解性8

第五节 增加蛋白质稳定性的策略9

一、宿主菌选择10

二、分泌型表达10

三、包含体11

第六节 大肠杆菌表达体系的基本操作流程11

一、基因片段的制备11

二、载体制备12

三、载体酶切消化反应和从凝胶进行载体的纯化和回收12

四、制备插入片段13

五、将基因片段克隆到表达载体14

六、筛选阳性克隆、测序分析16

七、转化表达宿主菌及诱导和优化目的蛋白表达16

八、培养放大及目的蛋白的纯化17

第二章 重组蛋白的分离纯化和复性18

第一节 概述18

第二节 分离纯化的方法策略及其应用20

第三节 包含体蛋白质的折叠复性22

一、蛋白质折叠的过程和机理24

二、包含体的分离和溶解25

三、溶解后包含体蛋白质的折叠复性26

第四节 可溶重组分子的分离纯化32

一、色谱技术在分离纯化中的应用33

二、亲和标签在重组蛋白分离纯化中的应用34

第五节 结语47

第三章 酵母表达系统48

第一节 几种主要酵母表达系统49

一、酿酒酵母表达系统49

二、甲醇营养型酵母表达系统50

三、裂殖酵母表达系统52

四、乳酸克鲁维亚酵母表达系统52

五、其他酵母表达系统52

第二节 酵母表达载体概况53

一、酵母载体的类型53

二、酵母载体的基本结构54

第三节 酵母表达系统的研究方向55

一、提高外源蛋白在酵母中的表达水平55

二、提高外源基因表达产物的质量55

第四节 酵母表达系统的应用和展望56

第四章 芽孢杆菌基因表达系统57

第一节 芽孢杆菌基因表达系统的特点57

第二节 芽孢杆菌表达载体58

一、自主复制质粒58

二、整合质粒58

三、噬菌体59

四、转化方法59

第三节 宿主菌59

第四节 外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达59

第五节 芽孢杆菌高效表达外源基因的策略及发展方向60

一、降低芽孢杆菌胞外蛋白酶活性60

二、提高表达质粒在细胞中的稳定性60

三、扩大芽孢杆菌宿主／载体表达系统61

第五章 哺乳动物细胞表达系统62

第一节 哺乳动物细胞表达载体65

一、表达载体基本种类与组成元件65

二、筛选标记基因66

第二节 常见的生产用细胞表达系统70

一、CHO表达系统70

二、鼠骨髓瘤细胞系70

三、COS细胞71

四、Vero细胞71

第三节 大规模哺乳动物细胞培养的新趋势71

一、抑制细胞凋亡71

二、可诱导表达73

三、新的生产工艺73

第六章 转基因动物表达系统74

第一节 制作转基因动物常用方法74

第二节 同源重组介导的基因打靶76

第三节 组织特异性表达——乳腺表达的调控元件80

一、乳汁酪蛋白81

二、乳清酸蛋白82

三、β-乳球蛋白基因83

第四节 显微注射法制备转基因小鼠技术85

一、注射DNA的纯化和定量85

二、转基因实验用鼠的种类85

三、超数排卵、受精卵收集和培养86

四、显微注射86

五、胚胎移植87

六、检测87

第五节 问题与展望89

第七章 转基因植物生物反应器91

第一节 引言91

第二节 转基因植物的原理与方法93

一、概述93

二、转基因植物的选择93

三、农杆菌介导的转基因技术94

四、病毒载体介导的转基因技术100

五、直接转化法获得转基因植物102

第三节 适于重组蛋白表达的植物宿主105

一、烟草105

二、谷类和豆类作物105

三、水果和蔬菜106

第四节 转基因植物表达重组蛋白研究进展107

一、转基因植物可食疫苗研究107

二、转基因植物抗体工程114

第五节 叶绿体转基因工程117

一、叶绿体基因组的特征117

二、叶绿体转化系统的优越性118

三、外源基因导入叶绿体的方法119

四、叶绿体中表达外源基因的研究进展120

五、存在问题与解决策略120

六、叶绿体遗传转化的前景和展望122

第六节 转基因植物安全标记基因的使用及抗性基因的剔除122

一、转基因植物使用的安全标记基因123

二、转基因植物中抗性基因的剔除126

三、展望130

第七节 理性认识转基因植物的安全问题130

一、转基因植物食品的安全问题130

二、转基因植物的生态安全问题132

参考文献135