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第一部分 组装3

1.离子通道的组装3

Ⅰ.引言3

Ⅱ.策略和方法5

参考文献16

第二部分 遗传学16

2.通过酵母双杂交系统鉴定离子通道关联的蛋白质21

Ⅰ.引言21

Ⅱ.酵母双杂交系统的原理22

Ⅲ.材料和方法23

Ⅳ.酵母双杂交系统的局限、前景和展望34

附录：溶液34

参考文献37

第三部分 电生理学37

3.囊性纤维化跨膜转运调节因子氯离子通道的膜片钳研究42

Ⅰ.引言42

Ⅱ.表达体系的选择42

Ⅲ.膜片钳技术43

Ⅳ.CFTR通道的通透性44

Ⅴ.CFTR氯离子通道的调控51

Ⅵ. DRSCAN：一种用于长时间记录分析的兼容性程序附录58

参考文献63

4.秀丽隐杆线虫（Celegans）神经元的紧密封接全细胞膜片钳66

Ⅰ.引言66

Ⅱ.概述66

Ⅲ.用于原位电生理的Celegans的制备67

Ⅳ.亚微米开度的膜片钳的构成70

Ⅴ.溶液70

Ⅵ膜片钳设置70

Ⅶ.GFP标记的神经元记录72

Ⅷ.紧密封接的全细胞记录73

Ⅸ.小细胞膜片钳记录的阐释75

Ⅹ.电压的空间控制77

Ⅺ.前景78

Ⅻ.总结78

参考文献79

5.门控电流81

Ⅰ.引言81

Ⅱ.门控电流的研究82

Ⅲ.单通道电荷83

Ⅳ.检测中的问题84

Ⅴ.分离中的问题85

Ⅵ.电压钳87

Ⅶ.记录步骤89

Ⅷ.门控电流的记录93

Ⅸ.基本门控事件96

Ⅹ.频域门控电流的记录98

参考文献100

6.离子通道通透性质的确定101

Ⅰ.引言101

Ⅱ.单离子电势102

离子通道的选择性103

Ⅳ.离子孔道的分类105

Ⅴ.孔道阻断研究105

Ⅵ.孔道占有情况的确定106

Ⅶ.结论107

参考文献108

第四部分 表达体系112

7.通过塞姆利基森林病毒（SFV）和杆状病毒表达配体门控的离子通道112

Ⅰ.引言112

Ⅱ.病毒DNA或RNA的生成118

Ⅲ.宿主细胞的选择和培养122

Ⅳ.病毒的扩增和滴定124

Ⅴ.实验参数的优化127

Ⅵ.杆状病毒和SFV表达离子通道的应用129

Ⅶ.结论132

参考文献133

8.由重组腺病毒介导的编码离子通道和突触功能相关分子的基因在神经系统中的表达135

Ⅰ.引言135

Ⅱ.重组腺病毒的准备136

Ⅲ.技术139

Ⅳ.钾离子通道的表达146

Ⅴ.腺病毒在急性海马脑片生理学中的应用148

Ⅵ.未来的方向152

参考文献153

9.异源离子通道的瞬时表达155

Ⅰ.更新155

Ⅱ.引言156

Ⅲ.方法158

Ⅳ.结果163

Ⅴ.总结175

参考文献175

第五部分 模型模拟179

10.离子通道的电脑模拟和建模179

Ⅰ.引言179

Ⅱ.基础统计方法183

Ⅲ.势能185

Ⅳ.非线性Poisson-Boltzmann方程200

Ⅴ.模拟步骤总结205

参考文献206

第六部分 物理212

11.测定离子通道活性的荧光技术212

Ⅰ.引言212

Ⅱ实验步骤213

Ⅲ.药理验证试验217

Ⅳ.钙离子高度应答性离子通道217

Ⅴ.钙离子中度应答性离子通道224

Ⅱ.钙离子低度应答性离子通道229

Ⅶ..基于荧光染料测定离子通道活性的钙离子浓度试验的局限233

Ⅷ.基于荧光染料钙离子浓度试验的优势234

参考文献235

12.分析离子通道结构和功能的配体结合方法238

Ⅰ.修改文稿介绍238

Ⅱ引言238

Ⅲ.方法比较239

Ⅳ.方法240

Ⅴ.荧光配体结合试验246

Ⅵ.配体结合分析247

Ⅶ.热动力循环分析251

参考文献254

13.二维结晶、冷冻电镜和成像分析决定的膜蛋白三维结构256

Ⅰ.引言256

Ⅱ.电子冷冻晶体学的膜蛋白结构分析的步骤258

Ⅲ.图谱阐释289

Ⅳ.结论293

参考文献294

14.毛细管电泳的电压钳生物感受器297

Ⅰ.引言297

Ⅱ.毛细管电泳299

Ⅲ.断裂电泳毛细管的构成301

Ⅳ.细胞制备303

Ⅴ.毛细管电泳膜片钳记录306

Ⅵ.双电极电压钳记录311

Ⅶ.总结313

参考文献313

15.离子通道作为监控脂双层与膜蛋白相互作用的工具：短杆菌肽作为分子力的传递者316

Ⅰ.近期发展316

Ⅱ.引言318

Ⅲ.蛋白质构象改变和脂双层扰动319

Ⅳ.膜扰动和通道功能321

Ⅴ.膜变形的能量322

Ⅰ.载体与通道-报告蛋白的选择324

Ⅶ.分子力传递者325

Ⅷ.测定△G（Ⅰ→Ⅱ）bilayer和现象的弹力常数327

Ⅳ.结论332

参考文献332

第七部分 纯化和重组338

16.上皮囊性纤维化跨膜转运调节因子氯离子通道的纯化和重构338

Ⅰ.更新338

Ⅱ.引言338

Ⅲ.CFTR在Sf9-杆状病毒系统中的表达341

Ⅳ.CFTR的溶解和纯化342

Ⅴ. CFTR的重组348

Ⅵ.重组CFTR通道功能特征的估测350

参考文献356

17.天然和克隆的通道在平面脂双层的重组359

Ⅰ.更新359

Ⅱ.引言和概述360

Ⅲ.大鼠肌肉T-小管细胞膜：一种K+通道和Nav+通道的可靠资源364

Ⅳ.天然组织中各种类型离子通道的制备和重组367

Ⅴ.克隆和异源表达的通道重组到平面脂双层的方法368

参考文献374

第八部分 第二信使和生化方法380

18.配体门控离子通道的蛋白质磷酸化380

Ⅰ.引言380

Ⅱ.配体门控离子通道磷酸化的生化性质分析380

Ⅲ.配体门控离子通道磷酸化的功能作用391

Ⅳ.结论395

参考文献395

19.离子通道关联蛋白的分析397

Ⅰ.引言397

Ⅱ.总体考虑399

Ⅲ.重组蛋白的体外结合399

Ⅳ.全长蛋白质在异源细胞中的整合403

Ⅴ.离子通道和关联蛋白在体内的共定位405

Ⅵ.天然组织中离子通道和关联蛋白的免疫共沉淀407

Ⅶ.结论409

参考文献410

20.离子通道的第二信使调控／植物膜片钳411

Ⅰ.更新411

Ⅱ.引言415

Ⅲ.暴露膜415

Ⅳ.植物细胞与动物细胞膜片钳的对比423

Ⅴ.离子通道的第二信使调控426

Ⅵ.结论性评语440

附录440

参考文献441

第九部分 特殊离子通道450

21. ATP敏感性钾离子通道450

Ⅰ.引言450

Ⅱ.药物合成451

Ⅲ.组织培养456

Ⅳ.转染操作456

Ⅴ.铷外流检测457

Ⅵ.膜的分离458

Ⅵ.光标操作458

Ⅷ.受体溶解459

Ⅸ.SUR1的部分纯化459

Ⅹ.额外纯化步骤460

Ⅺ.沉降461

Ⅻ.结合检测461

参考文献463

22.研究机械力门控通道的简化快速压力钳技术465

Ⅰ.引言465

Ⅱ.简化压力钳的机械排布466

Ⅲ.压力钳的电子控制468

Ⅳ.构建的一些实践经验470

附录472

参考文献472

23.抑制性甘氨酸受体的异源表达和纯化474

Ⅰ.引言474

Ⅱ.哺乳动物脊索中甘氨酸受体的纯化474

Ⅲ.甘氨酸受体的异源表达476

Ⅳ.HEK293细胞中瞬时表达482

Ⅴ.2 X BBS484

Ⅵ.杆状病毒系统485

参考文献485

24. Aquaporin水分子通道蛋白的功能分析488

Ⅰ.引言488

Ⅱ.红血球AQP1蛋白的纯化488

Ⅲ.AQP1在酵母中的表达491

Ⅳ.AQP1重组到蛋白脂质体中492

Ⅴ.AQP1蛋白脂质体的水渗透495

Ⅵ.用简并寡核苷酸PCR对Aquaporins的同源克隆497

Ⅶ.表达AQP1蛋白的蛙卵的水渗透503

参考文献507

第十部分 毒素和其他膜活性化合物511

25.离子通道的Conus多肽探针511

Ⅰ.引言511

Ⅱ.Conus探针的生化概述512

Ⅲ.处理Conus多肽中的一些实践经验524

参考文献526

26.蝎毒作为研究钾离子通道的工具529

Ⅰ.引言529

Ⅱ蝎毒液中钾离子通道多肽抑制剂的纯化531

Ⅲ.通过重组技术合成钾离子通道抑制剂多肽534

Ⅳ.钾离子通道抑制性多肽的放射性标记537

Ⅴ.受体结合研究540

Ⅵ.总结542

参考文献542

27.利用平面脂双层快速筛选膜活性化合物546

Ⅰ.更新546

Ⅱ.引言547

Ⅲ.一种新的双层膜系统549

Ⅳ.平面脂膜的设置和区室549

Ⅴ.材料552

Ⅱ.平面脂膜灌流技术的应用554

参考文献558

28.离子通道抗体561

Ⅰ.引言561

Ⅱ人类疾病中自发产生的抗体566

Ⅲ.配体门控的受体576

Ⅳ.电压门控型离子通道584

Ⅴ.商业产品585

参考文献586

索引591