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第1章　绪论1

1.1　研究背景1

1.1.1　研究的目的和意义1

1.1.2　研究内容及创新点2

1.2　漆酶的研究概况2

1.2.1　漆酶的来源、种类及分布2

1.2.2　漆酶的结构、特性及其作用机理2

1.2.3　漆酶的应用4

1.3　细菌漆酶研究概况7

1.3.1　产漆酶细菌的种类7

1.3.2　产漆酶细菌筛选方法进展11

1.3.3　细菌漆酶酶学性质的研究方法进展12

1.3.4　细菌漆酶应用的研究进展15

1.4　细菌漆酶的分子生物学研究进展17

1.5　固定化酶技术18

1.5.1　固定化酶的定义18

1.5.2　固定化酶的优点18

1.5.3　酶的固定化方法19

1.5.4　固定化酶的应用20

1.6　大肠杆菌表达系统21

1.6.1　大肠杆菌表达系统特点21

1.6.2　表达系统的构成21

1.6.3　重组基因的表达特点23

1.6.4　蛋白质表达部位24

第2章　产漆酶细菌的筛选与鉴定27

2.1　实验材料与仪器27

2.1.1　材料27

2.1.2　试剂27

2.1.3　仪器28

2.1.4　试剂配制及培养基28

2.2　实验方法31

2.2.1　筛选方法31

2.2.2　形态特性研究31

2.2.3　生理生化特性研究33

2.2.4　16S rDNA鉴定34

2.3　结果与分析38

2.3.1　高产漆酶菌株的分离38

2.3.2　形态及生理生化特性38

2.3.3　分子生物学鉴定40

2.4　讨论42

2.5　小结44

第3章　B.subtilis WD23的生物学及其酶学性质研究46

3.1　实验材料与仪器46

3.1.1　材料46

3.1.2　试剂与培养基46

3.1.3　仪器47

3.2　实验方法47

3.2.1　B.subtilis WD23的生物学特性47

3.2.2　粗提液的制备与酶活测定48

3.2.3　细菌芽孢漆酶酶学性质研究49

3.2.4　细菌芽孢漆酶对染料的脱色实验51

3.3　结果与分析51

3.3.1　B.subtilis WD23的生物学特性51

3.3.2　产芽孢率与细菌漆酶活性的关系54

3.3.3　细菌芽孢漆酶酶学性质研究55

3.3.4　细菌芽孢漆酶对染料的脱色实验60

3.4　讨论61

3.5　小结62

第4章　细菌芽孢漆酶的固定化及其应用63

4.1　实验材料63

4.1.1 菌株63

4.1.2　试剂与培养基63

4.1.3　仪器64

4.2　实验方法64

4.2.1 固定化细菌芽孢漆酶微胶囊的制备64

4.2.2　微胶囊性能测定方法65

4.2.3　芽孢漆酶酶活测定方法65

4.2.4　固定化芽孢漆酶酶学性质66

4.2.5　造纸废水黑液的降解试验68

4.3　结果与分析69

4.3.1　微胶囊性能测定69

4.3.2　固定化芽孢漆酶酶学性质70

4.3.3　造纸废水黑液的降解试验73

4.4　讨论75

4.5　小结75

第5章　B.subtilis WD23的CotA基因的克隆与异源表达77

5.1　材料77

5.1.1　菌株77

5.1.2　试剂77

5.1.3　仪器78

5.1.4　试剂配制及培养基78

5.2　实验方法79

5.2.1　B.subtilis CotA基因的克隆79

5.2.2　pET22b/CotA重组表达载体的构建及鉴定83

5.2.3　CotA重组蛋白的诱导表达条件的优化89

5.3　结果与分析92

5.3.1　CotA基因的PCR扩增92

5.3.2　重组质粒pMD18-T/CotA的构建及鉴定93

5.3.3　pET22b/CotA重组表达载体的构建及鉴定95

5.3.4　CotA重组蛋白的诱导表达条件的优化109

5.4　讨论112

5.5　小结115

第6章　CotA蛋白的纯化及其酶学特性的研究117

6.1　实验材料117

6.1.1 菌种117

6.1.2　试剂117

6.1.3　仪器117

6.1.4　试剂配制118

6.2　实验方法119

6.2.1　CotA蛋白的纯化119

6.2.2　CotA漆酶酶学性质的研究122

6.2.3　CotA漆酶对染料的脱色实验124

6.3　结果与分析125

6.3.1　CotA蛋白的纯化125

6.3.2　CotA漆酶酶学性质的研究127

6.3.3　CotA漆酶对染料的脱色实验130

6.4　讨论131

6.5　小结132

结论134

参考文献137